Люминесцентный микроскоп для чего
Люминесцентные или флуоресцентные микроскопы в настоящее время можно приобрести практически в любом магазине специализированно техники. Нет никаких серьезных проблем приобрести такое оборудование и в интернет-магазинах. Тем не менее, практически каждый человек желает получить качественный результат, но при этом не знают, как сделать максимально правильный выбор. Прежде всего, каждый человек должен понимать, что для того чтобы получить качественный результат необходимо знать некоторые особенности данного вида микроскопа, о которых мы сейчас с вами и поговорим. Здесь https://arstek.ru/product/oborudovanie/lyuminestsentnye-mikroskopy/ можно купить подобное оборудование без проблем.
Где используется микроскоп данного типа?
Если говорить о люминесцентных микроскопах, то в настоящее время они применяются во множестве отраслей науки. Прежде всего подобные микроскопы применяются в микробиологии, гистохимии и так далее. При помощи подобных микроскопов, гораздо эффективнее изучать живые типы клеток. Кроме всего прочего, такое оборудование является просто незаменимым вариантом в медицине, к примеру, для выявления злокачественных новообразований. Стоит понимать, что чем раньше будет выявлена такая проблема, тем быстрее можно будет добиться положительного результата и в конечном итоге полностью избавиться от заболевания. В современной медицине, а если быть более точным, то в исследовательской работе используется именно этот тип микроскопов.
Что касательно простых видов этих микроскопов, то они используются, в том числе и для школьных, домашних исследований и опытов. Тем не менее, стоит понимать, что это крайне дорогой вид оборудования, то покупать такой товар для домашних опытов нецелесообразно, как и для школьных опытов. Таким образом, люминесцентные микроскопы подойдут только для крупных лабораторий, если говорить непосредственно о целесообразности применения.
Устройство
По сути, данный вид микроскопа по сути самый обыкновенный световой микроскоп. Свои основные свойства он смог получить лишь благодаря некоторым незначительным на первый взгляд особенностям. В данном случае применяется несколько необычный тип осветителя – галогеновая лампа. В данном случае имеется возможность получить либо ультрафиолетовый или синий свет, который в обязательном порядке необходимо для получения люминесценции.
На данный тип микроскопов в обязательном порядке устанавливаются светофильтры. Стоит сказать, что в данном случае устанавливается сразу три типа светофильтров.
В чем особенности микроскопа данного типа?
Стоит сказать, что как и в любом другом виде техники, здесь имеются свои особенности, о которых необходимо знать в обязательном порядке, для того чтобы была возможность добиться максимально качественного результат именно в той области, в которой это необходимо.
Как бы там ни было, перед тем, как приобретать данное оборудование, в обязательном порядке, обратитесь за помощью к профессиональным консультантам, дабы получить точные данные о самом оборудовании и о целесообразности его применения конкретно в вашем случае.
Световая, люминесцентная, электронная микроскопия – разные методы исследований
Изучение микромира – это одновременно и увлекательно, и сложно. Если в самом начале, сразу после зарождения микроскопии, ученым был доступен только один метод исследований, сейчас их насчитывается уже более десятка. Самые широко распространенные методы микроскопии – это люминесцентная, темнопольная, светлопольная, поляризационная, фазового контраста. Некоторые из них можно использовать и для любительских наблюдений. А вот, например, методы электронной микроскопии созданы для решения сугубо профессиональных задач.
Люминесцентная микроскопия
В люминесцентной микроскопии используется явление свечения веществ при облучении их ультрафиолетом. Разделяют понятия первичной и вторичной люминесценции. Первичную демонстрируют лишь редкие образцы, вторичная проявляется у всех веществ, окрашенных красителями (флюорохромами). При люминесцентном методе исследований образец поглощает короткие волны и излучает длинные, которые можно наблюдать в видимом диапазоне. Люминесцентная микроскопия в микробиологии используется для изучения нуклеиновых кислот в клетках, бактериоскопии возбудителей инфекций, цитохимических исследований живых микроорганизмов. Метод незаменим в диагностике заболеваний и широко применяется в медицине.
Методы люминесцентной микроскопии
В люминесцентной микроскопии применяются несколько методов исследований. В микробиологии обычно используют два из них: окрашивание флюорохромами (флюорохромирование) и метод флюоресцирующих антител. Последний еще называется реакцией иммунной флюоресценции (РИФ). Мы не будем углубляться в тщательное описание каждого метода, так как объема одной статьи для этого не хватит. Отметим, что существует еще конфокальная микроскопия – тоже метод люминесценции, который позволяет изучать образцы на некоторой глубине.
Поляризационная, конфокальная, электронная, люминесцентная микроскопия – это методы изучения микромира. Некоторые появились вместе с первыми микроскопами, другие же были придуманы в последние сто лет. Наука не стоит на месте, а способы наблюдений меняются, совершенствуются и становятся все более эффективными. Вы тоже можете совершенствовать свои умения, используя более современную и актуальную оптическую технику. В нашем интернет-магазине вы найдете микроскопы не только для любителей, но и для профессионалов. Наши консультанты готовы ответить на любые ваши вопросы, рассказать о выгодных предложениях и акциях. Звоните или пишите!
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Люминесцентные микроскопы
Флуоресцентные (люминесцентные) микроскопы используются для исследований как органических, так и неорганических образцов, обладающих свойством флуоресценции, т.е. способностью переизлучать часть поглощённой ими световой энергии.
Такие микроскопы отличаются от моделей с проходящим светом наличием флуоресцентного модуля отражённого света, который состоит из следующих узлов:
— источник света для возбуждения флуоресценции. Может оснащаться как ртутной лампой с широкополосным спектром свечения, так и узкополосной светодиодной лампой для возбуждения определённого красителя светом точно подобранной длины волны;
— турель или слайдер для установки вводящихся в световой поток наборов светофильтров (кубов);
— наборы светофильтров (кубов);
— специализированные серии объективов с низкой автофлуоресценцией (полу-Апохроматы (Флуориты) или Апохроматы);
— специализированные цифровые камеры с высокими показателями светочувствительности и низкими показателями шумности.
Принцип работы:
— ртутная лампа излучает свет широкого спектра;
— через возбуждающий светофильтр флуоресцентного куба проходит узкая часть света такой длины волны, которая необходимая для возбуждения конкретного красителя (флуорохрома);
— свет полностью отражается дихроическим зеркалом (барьерным фильтром) флуоресцентного куба и перенаправляется на образец;
— свет определённой длины волны поглощается красителем, который, возбуждаясь, начинает излучать свет длиной волны со сдвигом по спектру вправо относительно возбуждающего света;
— излучаемый красителем свет, пройдя через объектив, опять проходит через дихроическое зеркало, но теперь она полностью пропускает через себя весь свет, не отражая и не перенаправляя его;
— далее свет проходит через эмиссионный светофильтр флуоресцентного куба, который пропускает через себя свет только ожидаемой от этого красителя длины волны;
— и, наконец, свет попадает в обычную систему наблюдения микроскопа (тубус, цифровая камера, окуляр, глаз наблюдателя).
ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
В истории развития Л. м. выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:
1) доказательство А. Келером принципиальной возможности создания люминесцентного микроскопа; 2) создание в 1911 г. люминесцентного микроскопа, который был использован русским ботаником М. С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток; 3) применение сильно разбавленных р-ров флюорохромов, избирательно связывающихся с определенными структурами клеток [Хайтингер (М. Haitinger, 1933— 1935)], и прежде всего акридинового оранжевого [Хайтингер, Штруггер (S. Strugger), 1940]; 4) разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки (E. М. Брумберг и Г. Н. Крылова, 1953) и выпуск отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе (МЛ-1, МЛ-2, ОИ-17); 5) создание метода иммунофлюоресценции (см.), нашедшего широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико-биол. исследований [Кунс (А. Н. Goons), 1942, 1950].
В СССР значительный вклад в развитие и распространение Люминесцентной микроскопии в медико-биологических исследованиях сделан М. Н. Мейселем.
Для проведения Л. м. применяют либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биол, микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов (см. Микроскоп). Устройство люминесцентных микроскопов основано на некоторых физ. законах люминесценции. Один из них — закон Стокса, согласно к-рому максимум спектра люминесценции смещен в длинноволновую область по отношению к спектру возбуждающего света. Это позволяет использовать для Л. м. принцип скрещенных светофильтров, который заключается в том, что коротковолновое световое излучение (ультрафиолетовое, сине-фиолетовое), возбуждающее люминесценцию, выделяется возбуждающим светофильтром, помещенным перед осветителем микроскопа. После прохождения препарата, в к-ром возбуждается люминесценция, этот свет полностью поглощается запирающим светофильтром, пропускающим более длинноволновый свет люминесценции.
Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения к-рого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой (или набором таких пластинок), применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак-иллюминатор, используемая в отечественных люминесцентных микроскопах (а в последнее время и в люминесцентных микроскопах, выпускаемых зарубежными фирмами), имеет ряд существенных преимуществ: 1) интерференционная светоделительная пластинка с нанесенными на нее слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции; 2) объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещенность препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвертой степени апертуры объектива; 3) люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа. Источниками освещения для Л. м. чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также ксеноновые лампы и кварцево-галогенные лампы накаливания. В качестве светофильтра применяют окрашенное в массе оптическое стекло или используют интерференционные светофильтры, имеющие лучшие спектральные характеристики.
Для возбуждения люминесценции при Л. м. пользуются также оптическими квантовыми генераторами— лазерами, излучение которых обладает высокой интенсивностью и монохроматичностью. При этом отпадает необходимость в применении возбуждающих светофильтров.
Поскольку для возбуждения люминесценции при Л. м. обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зеленую область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычную стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стекла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям.
В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный р-р глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт и др.).
М. Я. Корном и М. М. Бутсловым с сотр. (1968) разработана аппаратура и методика цветной люминесцентной микрофото- и киносъемки с использованием электронно-оптических усилителей яркости, позволяющих на несколько порядков уменьшить экспозицию и проводить регистрацию динамики процессов, происходящих в живых клетках.
Для количественной регистрации интенсивности люминесценции структур микрообъектов — цитофлюориметрии — применяют преимущественно фотоэлектрические методы с использованием фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в качестве чувствительного регистрирующего прибора (см. Фотоумножители). Используют также метод регистрации интенсивности люминесценции клеток и их структур в определенных участках спектра — цитоспектрофлюориметрию. Преимущества цитофлюориметрии перед абсорбционной цитофотометрией — ее более высокая чувствительность, отсутствие влияния характера распределения вещества в клетке пли структуре клетки на результаты измерений.
Одним из вариантов количественной регистрации люминесценции микрообъектов является метод импульсной цитофлюориметрии (цитофлюориметрии в потоке) и «сортировки» клеток по люминесцентным характеристикам. Эти методы позволяют проанализировать интенсивность люминесценции десятков тысяч клеток в минуту и провести их разделение по характеру люминесценции. Среди методов люминесцентного изучения микрообъектов наибольшее распространение получили прямое флюорохромирование — окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция.
Отечественная промышленность выпускает различную аппаратуру для Л. м. Наиболее широко используется микроскоп МЛ-2, выпускаемый в нескольких вариантах. Производится также серия унифицированных люминесцентных микроскопов «Люмам», а также люминесцентные осветители с кварцевыми галогенными лампами (ОИ-28, ОИ-30).
Микроскопы серии «Люмам» состоят из унифицированных узлов, различные комбинации которых позволяют получить три рабочие модели (Р1 — РЗ) и три исследовательские (И1 — И3), отличающиеся друг от друга комплектацией и возможностями использования (рис. ).
Осветители ОИ-28 и ОИ-30 устанавливают на обычные биологические микроскопы; они предназначены для освещения объектов сверху через опак-иллюминатор светом, возбуждающим видимую люминесценцию.
Осветитель ОИ-30 отличается тем, что в его комплект входят контактные объективы.
Люминесцентную микроскопию широко применяют в вирусологии, микробиологии, гематологии, клин, цитодиагностике (особенно в онкологии для обнаружения малигнизированных клеток), в цитогенетике для изучения хромосом. С этой целью на протяжении длительного времени используют флюорохром акридиновый оранжевый; применяют также флюорохромы бромистый этидий (этидиум бромид) и йодистый пропидий (припидиум йодид), преимущественно для цитофлюориметрии ДНК, а также люминесцентные варианты реакции Фейльгена. Акридиновый оранжевый получил распространение в люминесцентной микроскопии нуклеопротеидов благодаря тому, что комплексы, образованные этим флюорохромом с двуспиральной ДНК, обладают зеленой люминесценцией, а комплексы с РНК и односпиральной ДНК — красной люминесценцией. Известны также люминесцентно-цитохим. методы выявления белков и липидов. Для качественного и количественного изучения локализации белков в клетках используют проционовые красители, флюорескамин, а липидов — 3,4-бензпирен, фосфин ЗР и др. Тетрациклин и его производные применяют для люминесцентно-микроскопического изучения костной ткани и некоторых изменений в клетках при малигнизации.
Л. м. в сочетании с прямым флюорохромированием фиксированных препаратов используют при бактериоскопической диагностике для обнаружения кислотоустойчивых микобактерий, гонококков, возбудителей дифтерии, возбудителей малярии в мазках крови и др. Преимущества этого метода заключаются в его более высокой чувствительности по сравнению с обычными методами окраски (напр., окраски по Цилю—Нельсену). Флюорохромирование применяют также в санитарно-бактериол. исследованиях для обнаружения и подсчета микроорганизмов в воде и почве. Одним из методов люминесцентномикроскопической диагностики является обнаружение микроколоний на мембранных фильтрах после кратковременного подращивания и флюорохромирования.
Еще в 1940 г. Штруггер предложил использовать акридиновый оранжевый для дифференциации живых и мертвых бактерий, однако последующие исследования показали недостаточную надежность этого метода. В связи с этим для определения жизнеспособности клеток (в частности, при воздействии на них цитотоксических факторов) используют диацетат флюоресцеина или его сочетание с бромистым этидием. Нелюминесцирующий эфир флюоресцеина расщепляется эстеразами жизнеспособной клетки с освобождением ярко люминесцирующего зеленым флюоресцеина, а бромистый этидий обусловливает красную люминесценцию только мертвых клеток.
Для изучения физ.-хим. состояния мембран клеток используют так наз. гидрофобные флюоресцентные пробы. С этой целью клетки обрабатывают веществами, которые не люминесцируют в р-ре, но начинают люминесцировать, связываясь с гидрофобными участками мембран клетки, причем интенсивность и цвет люминесценции зависят от хим. строения и физ.-хим. состояния структур, с к-рыми связаны эти флюорохромы. Одним из наиболее распространенных веществ такого рода является 1-анилино-S-нафталин-сульфоновая к-та (1,8 АНС).
Методом изучения физ.-хим. состояния макромолекул, с к-рыми связаны флюорохромы в различных клеточных структурах, является также поляризационная люминесцентная микроскопия.
Существенное преимущество Люминесцентной микроскопии перед другими методами микроскопического исследования — возможность прижизненного (цветн. рис. 1—3) и суправитального флюорохромирования с использованием очень низких малотоксичных концентраций флюорохромов. При этом различные флюорохромы могут связываться с разными структурами клеток. Акридиновый оранжевый, напр., накапливается в лизосомах живой клетки, и они начинают люминесцировать красным светом. Такую же люминесценцию приобретают фагоцитированные бактерии внутри фагосом. Тетрациклин связывается с митохондриями клеток или их аналогами у бактерий и люминесцирует желто-зеленым светом, причем интенсивность люминесценции (количество связавшегося тетрациклина) зависит от чувствительности бактерий к этому антибиотику.
Возможно также флюорохромирование клеток и тканей in situ для изучения их с помощью контактной Л. м.
Люминесцентная микроскопия вирусов применяется при лаб. диагностике вирусных заболеваний для выявления вирусного антигена в клетках, изучения хим. состава внутриклеточных вирусных включений, определения относительной концентрации вирусных антигенов и нуклеиновых к-т по интенсивности специфической флюоресценции и т. д. В зависимости от целей исследования в качестве объектов используют мазки, отпечатки, соскобы тканей или препараты клеточных культур.
В современной вирусологии наиболее распространены два метода Л. м.: 1) идентификация и дифференциация нуклеиновых к-т вирусов в инфицированных клетках и очищенных вирусных суспензиях с помощью флюорохромов аминоакридинов; 2) выявление вирусных антигенов с помощью иммунофлюоресценции.
Из аминоакридинов чаще применяют акридиновый оранжевый, придающий молекулам двуспиральных нуклеиновых к-т (как правило, ДНК) зеленую, а односпиральных нуклеиновых к-т (как правило, РНК) рубиново-красную флюоресценцию (цветн. рис. 4—8). Метод применим как на нативных препаратах, так и после фиксации в ацетоне, жидкости Карнуа и др. Результаты окраски в значительной мере зависят от концентрации (обычно 1 : 10 000 — 1 : 100 000) и pH флюорохрома.
Метод иммунофлюоресценции используют для идентификации вирусов в клетках, изучения динамики накопления вирусного антигена в клетке, определения внутриклеточной локализации скоплений вируса, выяснения природы вирусных включений, изучения антигенной структуры вирусов, дифференциации близкородственных вирусов, титрования вирусов в клеточных культурах, выявления антигенов опухолеродных вирусов в тканях и клетках, изучения патогенеза вирусных заболеваний, контроля вирусной контаминации клеточных культур, исследования хрон, вирусных инфекций и т. д. Метод применим как в прямой, так и в непрямой модификациях. Для правильной интерпретации результатов исследования важно учитывать концентрацию и чистоту применяемых антител и их конъюгатов с флюорохромами, сроки и температуру фиксации препаратов (обычно ацетоном) и обработки их антителами. Наиболее часто для метки антител используют изотиоцианат флюоресцеина (ФИТЦ), дающий характерное зеленое свечение (цветн. рис. 9), и сульфохлорид лиссамин-родамина В 200, светящийся оранжево-красным светом.
Метод иммунофлюоресценции допускает также выявление в клетках и тканях антител к вирусным антигенам.
Л. м. вирусов применяют для диагностики таких инфекций, как оспа, герпес, эпидемический паротит и др. Особое значение имеет Л. м. в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, когда отпечатки со слизистой оболочки носа больных (риноцитограммы) обрабатывают с помощью названных выше методов с целью выявления антигенов или определения типа нуклеиновых к-т. Т. о. проводят дифференциальную диагностику между инфекциями, вызванными вирусами гриппа А2 или В, парагриппа, аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом или сочетаниями названных вирусов. Возможна также диагностика путем Л. м. клеточных культур, инфицированных материалом больных. Окончательный диагноз во всех случаях ставят по сочетанию данных Л. м. с результатами вирусологических и серологических исследований больных.
Люминесцентная микроскопия органов и тканей — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патол, гистологии. Основными преимуществами Л. м. являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим, методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию. Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение, возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин B2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин B1 в щелочном р-ре переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной к-ты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид— голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохим, количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.
Вторичная люминесценция органов и тканей достигается с помощью обработки препаратов флюорохромами (см.). Акридиновый оранжевый применяют для диагностики рака в цитол, и гистол, препаратах. Этот же краситель используют для определения ранних сроков инфаркта миокарда (участки ишемии имеют зелено-желтую люминесценцию). Корифосфин и акридиновый оранжевый применяют для выявления кислых мукополисахаридов. Такие флюорохромы, как кофеин 5 и родамин, могут быть использованы для определения гликогена. Фосфин 3Р применяют для определения липидов, с этой же целью используют р-р 3,4-бензпирена в насыщенном р-ре кофеина (липиды имеют голубовато-белую люминесценцию). Тиофлавин Т. S. окрашивает амилоид (зеленая люминесценция), поэтому его широко применяют для диагностики амилоидоза внутренних органов. С помощью р-ра морина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция). При обработке препаратов р-ром солохрома черного удается выявить алюминий (желто-оранжевая люминесценция). С помощью родамина 6Ж в легких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).
С помощью метода иммунофлюоресценции можно выявить гормоны, антигены и антитела (цветн. рис. 9), различные продукты обмена, идентифицировать гистогенетически незрелые опухоли, различные инфекционные заболевания и т.д. Развитие иммунохимии еще больше расширило возможности этого метода. Появилась возможность определять с помощью искусственных гаптенов небелковые вещества в тканях и клетках.
М. Я. Корн; В. А. Варшавский (пат. ан.), Я. E. Хесин (вир.).