Мазок на рнк что это
ПЦР-диагностика Ковид-19
Пандемия коронавируса, охватившая весь мир, считается наиболее масштабной и опасной за всю историю человечества. Согласно последним данным, на конец сентября 2020 года общее число заболевших превышает 32 миллиона человек, из числа которых свыше 950 тысяч погибших.
Врачи по всему миру прикладывают максимум усилий, направленных на предотвращение распространения инфекции, а также сокращение смертности среди населения.
Для наилучшей эффективности противоэпидемических мероприятий важно подобрать наиболее экономную и информативную систему тестирования, именно такой является ПЦР-диагностика.
Посредством выделения РНК вируса возможно обнаружить возбудитель в организме человека даже при его минимальной концентрации. Благодаря этому удается начать лечение заблаговременно, предотвратив прогрессирование Ковид-19 до тяжелых форм или убедиться в том, что человек полностью здоров. Сегодня такая возможность имеется и у пациентов нашей клиники.
Принцип проведения ПЦР-диагностики на Ковид-19
ПЦР или полимеразная цепная реакция – современный метод лабораторных исследований, который позволяет с предельной точностью выявлять различные инфекции в организме человека, включая Ковид-19. Результаты анализа максимально точны, исключается даже вариант ложноположительного теста. Однако в отношении COVID-19, в силу новизны и недостаточной изученности вируса, точность ПЦР-диагностики составляет порядка 80%.
Суть метода заключается в обнаружении молекул РНК вируса во взятом биологическом материале. В отношении диагностики коронавируса исследуемым биоматериалом становится мазок слизистой ротоглотки и носоглотки.
Особое внимание при этом уделяется именно РНК SARS-CoV-2, то есть рибонуклеиновой кислоте, являющейся носителем генетической информации вируса. Но даже если при первом исследовании РНК вируса не выявлены, подозрения все же могут оставаться (что не связано с возможной погрешностью).
Как известно, инкубационный период в случае Ковид-19 составляет 14 дней, по этой причине полностью исключить болезнь удается после проведения повторной диагностики. При этом все же стоит отметить главное преимущество ПЦР-тестов – это один из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний. Это значит, что проведение даже единичного исследования с высокой долей вероятности даст точный результат и позволит определить, болен ли человек на момент забора биоматериала.
Специфика анализа РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19)
РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19) можно назвать стандартный ПЦР-тест на коронавирус. В данном случае выполнение исследования занимает 2 дня с момента забора биоматериала. В случае положительного результата исследования человек считается инфицированным. Если же РНК коронавируса не выявлена, тест отрицателен, можно с уверенностью говорить о том, что человек не является носителем вируса.
Специфика анализа РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19) (CITO)
РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19) (CITO) – схожее по принципу забора биоматериала и методу проведения исследование. Разница заключается лишь в скорости, припиской «CITO» обозначается экспресс-тест, который, в отличие от стандартного метода исследования, проводится в течение нескольких часов. Несмотря на то, что результат будет готов уже спустя 3-4 часа, это не влияет на показатели точности, но такой вариант диагностики обходится дороже.
Особенности забора биоматериала
Процесс забора биоматериала – важнейший этап в ПЦР-диагностике. Крайне важно получить чистый образец, ведь от этого зависит точность и результативность исследования. К счастью, для проведения ПЦР-тестов на ковид процесс взятия мазка из носоглотки и ротоглотки предельно прост и не требует предварительной подготовки со стороны пациента:
Экспресс-тест NowCheck COVID-19 AG – набор исследований для максимально быстрой и простой диагностики новой коронавирусной инфекции. Тест позволяет выявить антигены COVID-19 в слизи из носоглотки методом ИХА (иммунохроматографии). По точности и достоверности он приближен к анализу ПЦР, но в отличие от него не требует специальных условий и оборудования.
Тест зарегистрирован в реестре медицинских изделий и имеет медицинское регистрационное удостоверение РФ. Метод, который лежит в основе исследования, получил одобрение Министерства здравоохранения России.
Диагностика занимает в среднем 15-30 минут, что позволяет максимально быстро заподозрить коронавирусную инфекцию и принять решение о госпитализации.
Показания к проведению исследования
ПЦР-диагностика коронавируса с предельно высокой на сегодняшний день точностью позволяет получить ответ на конкретный вопрос – болеет ли человек коронавирусом в данным момент. Это исследование не позволяет узнать, переболели вы ранее или нет.
Таким образом, учитывая текущие карантинные меры во многих странах, данный метод диагностики особенно актуален для людей, которые собираются поехать за границу или возвращаются домой.
В таких реалиях показаниями к проведению ПЦР теста являются:
Сертификация
Лаборатория, проводящая данное исследование обладает всеми необходимыми сертификатами для проведения ПЦР-диагностики на COVID-19 (коронавирус). Лабораторные исследования проводятся согласно международным стандартам на современном диагностическом оборудовании.
Заключение о проведенном исследовании выдается пациенту на специальном бланке с печатями, подтверждающими действительность документа. Кроме того, в нашей Клинике выдача сертификата об отсутствии болезни также осуществляется на английском языке, что будет кстати при поездах за границу.
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
ПЦР-тест
Методика, преимущества и недостатки анализа
Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости.
Анализ ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. В его основе лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов РНК и ДНК. Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Он хотел добиться того, чтобы можно было создать множество копий ДНК за счет фермента ДНК-полимеразы, который участвует в ее репликации. За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать. Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике.
Как работает ПЦР
Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование.
«Применяется специальный прибор, он называется амплификатор, в который помещается частица вируса или еще что-нибудь, содержащее РНК или ДНК, – рассказал РИА Новости кандидат медицинских наук, клинический фармаколог Андрей Кондрахин. – Дело в том, что РНК и ДНК достаточно маленькие, чтобы их определить, и понять есть ли в теле человека вредоносные микроорганизмы, поэтому делают ПЦР-тест. В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть». Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Для определения COVID-19 есть отдельный праймер. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК. Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание».
Применение ПЦР
ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими.
«Метод применяется не только для вирусов, но и частичек ДНК, а также бактерий, – пояснил специалист. – Например, мы можем определить, к какому виду бактерия относится, например, к грамотрицательным или грамположительным».
Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности.
Проведение ПЦР
Для анализа требуется ДНК- или РНК-матрицы, участки которых нужно скопировать, два праймера с необходимыми ферментами, термостабильная ДНК-полимераза, а также некоторые другие компоненты. Метод ПЦР выявляет любую ДНК или РНК живого или мертвого возбудителя. Для их определения используют особые праймеры, в которых содержатся вырожденные позиции РНК или ДНК.
Подготовка материала
Этот этап чрезвычайно важен для проведения анализа ПЦР, потому что большинство ошибок, до 70% случаев, совершается именно во время пробоподготовки, что влияет на конечный результат анализа. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его. Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.
Какие биологические материалы исследуются
В исследовании обычно используются различные биоматериалы:
– Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин.
– Мокрота. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких.
– Биологические жидкости – околоплодная, спинномозговая, суставная и т.д.
– Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.
– Кровь, сыворотка, плазма. Используются для определения вирусов ЦМВ (цитомегаловируса), ВИЧ, гепатитов B, C, D, G, герпеса, а также исследований человеческих генов.
– Биоптаты. Их забирают методом биопсии.
Преимущества и недостатки метода
ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется.
«Преимуществом метода является то, что можно определить возбудителя в малом количестве, просто в мизерном, – объяснил клинический фармаколог. – Благодаря этому можно быстрее поставить диагноз, потому что мы знаем, какой именно микроорганизм начинает развиваться. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме».
По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала:
«Самый первый недостаток метода – необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать. Второе – чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры – кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый – по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера. Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования».
Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.
Разновидности ПЦР
ПЦР-тест бывает нескольких видов:
– ПЦР с обратной транскрипцией. Его применяют для амплификации РНК.
– Инвертированная ПЦР используется, если для анализа есть маленький участок последовательности ДНК или РНК.
– Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
– Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции.
– Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров.
Кроме этого, есть асимметричная ПЦР и групп-специфическая ПЦР.
«Существует методика проведения ПЦР в реальном времени, – рассказал Андрей Кондрахин. – Это самый быстрый анализ, как говорится, здесь и сейчас. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус. Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее».
Какие инфекции позволяет выявить
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить у человека инфекционные заболевания, например:
– уреаплазмоз половых органов;
– наличие раковых клеток;
Также тестирование помогает выявить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям и оценить гормональный фон.
ПЦР-тест на COVID-19
Для ПЦР-теста на коронавирус у человека берется мазок из носа и ротоглотки. Во время пандемии его рекомендуют сдать всем, кто болеет ОРВИ, гриппом, пневмонией и т.д. Берут материал для анализа амбулаторно, также специалист может выехать на дом. Согласно требованиям, пациента выписывают после двух отрицательных тестов на наличие инфекции. ПЦР-тесты могут давать ложноположительный или ложноотрицательный результат, в таком случае необходимо повторное исследование.
Как подготовиться к сдаче анализа
«Специальной подготовки вообще не требуется, разве что не принимать пищу за три часа (минимум) перед забором материала, если будут брать мазок из ротовой полости. Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», – пояснил специалист.
Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами. Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна.
Расшифровка анализа ПЦР
После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками.
«В конце теста машина сообщает, что она нашла в мазке, а врач-лаборант описывает результат, – объяснил эксперт. – Если в программу машины заложена информация о том, при каких количествах считается тест положительным, значит, это будет делать автомат. В анализе будет либо да, либо нет. Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной – это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой. Все равно контроль со стороны врача присутствует».
Насколько точна ПЦР-диагностика инфекций
«ПЦР абсолютно точна, практически 99,9%, потому что аппарат построит абсолютно такую же РНК, как слепок с ключа, один в один. Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», – отметил Андрей Кондрахин.
При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус.
Вирусная нагрузка. Что это за показатель и как правильно его интерпретировать.
Современные возможности ПЦР диагностики COVID-19 в лаборатории ДИЛА позволяют ответить на несколько действительно важных вопросов:
От показателя ВН (высокая, средняя, низкая) напрямую зависит заразность инфицированного человека для окружающих.
Интенсивнее всего вирус размножается за 1-3 дня до появления симптомов и в первые 5-7 дней после первых проявлений. В этот период количество вирусов в 1 мл выделений из носоглотки может составлять сотни тысяч и миллионы частиц, что соответствует среднему и высокому показателю вирусной нагрузки и делает пациента максимально заразным для окружающих. Затем количество вирусов, выделяемых человеком начинает снижаться. Обычно начиная с 7-10 дня от начала клинических проявлений человек перестает быть заразным, что соответствует снижению показателей вирусной нагрузки. В этот период вирусная РНК в анализе еще может выявляться (ПЦР позитивный с низким уровнем ВН), однако большинство исследований показывает, что после 10 дня клинических проявлений вирус теряет свою способность к репликации (размножению), а значит, и способность заражать других людей.
Как определяется ВН и что значит показатель Сt*
Как понимать полученный результат исследования
Если значение Ct низкое (5-15), это говорит о том, что вирусная нагрузка высокая и вирус SARS COV-2 передает свою генетическую информацию и размножается очень активно, образуя новые вирусные РНК в большом количестве и тем заразнее человек.
Если вирусных частичек мало, для их выявления нужно большее количество циклов. Чем выше значение порогового цикла (Ct=30-35-40), тем меньше вирусных частиц находится в образце.
Результат ПЦР отрицательный в том случае, если РНК вируса выявить не удается даже при самом высоком пороговом цикле чувствительности прибора – более 40 циклов амплификации (Сt больше 40: РНК SARS COV-2 не выявлена).
Сt 5-27.
Высокая ВН
Сt 28-34.
Средняя ВН
Человек болен COVID-19, есть риск заражения окружающих.
Рекомендуется:
Человек заражен COVID-19, есть риск заражения окружающих.
Рекомендуется:
Ct 35-40.
Низкая ВН
Человек болен COVID-19, риск заражения окружающих сохраняется, но он вероятно низок. Возможно самое начало заболевания.
Рекомендуется:
Человек заражен COVID-19. Чаще всего это может быть в период выздоровления (выведения вируса).
Рекомендуется (если был контакт с больным COVID-19):
Риск заражения окружающих отсутствует.
Возможно:
Для уточнения диагноза рекомендуется:
Риск заражения окружающих отсутствует.
Тест на імуноглобуліни класу G допоможе уточнити, чи перехворіли ви на коронавірусну інфекцію раніше.
При обнаружении любого из определяемых генов коронавируса результат теста является положительным, что означает присутствие вируса в организме.
Важно помнить, что клинические проявления заболевания могут отсутствовать при любом уровне вирусной нагрузки. При положительном результате ПЦР с высоким уровнем вирусной нагрузки и отсутствии симптомов заболевания (бессимптомном течении) вы высоко заразны для окружающих, поскольку из носоглотки выделяется много вирусов при дыхании, разговоре. Для контроля снижения заразности можно провести повторное ПЦР-тестирование с определением уровня вирусной нагрузки через 7-10 дней