Микро рнк что это

Микро рнк что это

представляют собой класс малых некодирующих молекул РНК длиной 18–25 нуклеотидов, которые активно участвуют в регуляции экспрессии генов.

Действие микроРНК очень многообразно и тесно связанно со многими процессами, происходящими в организме, в том числе с: поддержанием стабильности генома, иммунными реакциями, дифференцировкой, пролиферацией, апоптозом клеток, как в норме, так и при различных патологиях. И последнее обстоятельство делает их привлекательными для исследователей и медиков сразу по двум направлениям: в качестве терапевтической мишени и потенциального биомаркера для диагностики практически всех возрастных (и не только) болезней.

Первая микроРНК, названная lin-4, была открыта четверть века назад учёными из Гарвардского университета у нематоды С. еlegance [1]. Учёные обнаружили, что ген lin-4 кодировал не белок, а две небольшие РНК — предшественник длиной в 61 нуклеотид и саму микроРНК в 22 нуклеотида, которая и подавляла экспрессию нематодного гена lin-14, не давая ей нормально развиться.

Долгое время считалось, что микроРНК — это такая эволюционная экзотика, свойство генома нематоды, пока спустя семь лет, в 2000 году, не была открыта вторая молекула микроРНК, let-7 [2].

Она подавляла экспрессию сразу нескольких генов и затем была описана у ряда живых организмов, в том числе и у человека. И после этого «плотину прорвало» — открытия микроРНК стали следовать одно за другим.

Сегодня известно, что каждая микроРНК может контролировать множество (до нескольких сотен) генов, при этом один конкретный ген может являться мишенью для нескольких микроРНК.

Как же действует эта малая молекула?

Около 10 лет назад было впервые описано, что секретированные одним типом клеток микроРНК могут переноситься в другие типы клеток. Это послужило поводом предположить, что кроме клеточной микроРНК, в организме присутствует и внеклеточная, т.н. циркулирующая микроРНК (circulating miRNA, c-miPHK), которая и была затем обнаружена в плазме крови и других биологических жидкостях.

Как предполагается сегодня, появление c-miPHK в крови может быть результатом как секреции их клетками, так и гибели самих клеток при апоптозе и некрозе.

Для диагностики каких патологий можно использовать анализ микроРНК? В первую очередь, это конечно же основные возрастные болезни — сердечно-сосудистые, нейродегенеративные и онкологические. Так, проведённые многочисленные исследования показали тесную связь между уровнями микроРНК и сердечно-сосудистыми заболеваниями (CCЗ) — микроРНК играют важную роль в развитии и патогенезе ССЗ, что даёт возможность использовать их в качестве диагностического маркера на самых ранних стадиях. Сегодня уже известно несколько микроРНК, подходящих для этой цели.

Ещё в 2009 году в одном из первых исследований было показано, что микроRNA miRNA-208 специфично продуцируется в клетках сердца и её концентрации в плазме крови являются точным индикатором миокардиального повреждения [5]. Позже учёные смогли идентифицировать ещё две микроРНК, miR-423-5p и miRNA-499, которые показали хорошую эффективность при диагностике сердечной недостаточности и острого инфаркта миокарда [6, 7].

В течение 10-летнего периода, в ходе большого исследования в рамках Nord-Trøndelag Health Study, норвежскими учёными был выявлен ряд циркулирующих микроРНК (miR-106a-5p, miR-424-5p, let-7g-5p, miR-144-3p и miR-660-5p), уровни которых могут предсказывать будущий острый инфаркт миокарда у пока ещё здоровых людей [8]. Причём, эта же работа показала, что у мужчин и женщин есть свои специфические микроРНК (miR-424-5p и miR-26a-5p), связанные с риском инфаркта миокарда.

Подробный систематический обзор известных на сегодня микроРНК, потенциальных биомаркеров сердечно-сосудистых болезней, был сделан в 2018 году российскими кардиологами [9].

В 2018 году был опубликован большой систематический обзор, в который было включено восемь исследований, включающих 572 больных и 431 здоровый участник в контрольной группе. Согласно этому обзора, на сегодня известно как минимум 22 микроРНК, дифференциальная экспрессия которых была зарегистрирована в самом раннем периоде после острого ишемического инсульта [11].

Но, пожалуй, наиболее эффективно микроРНК зарекомендовали себя в качестве биомаркеров в ранней диагностике онкологических заболеваний. Так, в 2014–2017 гг. было проведено несколько масштабных исследований, систематических обзоров и метаанализов, показавших, что профили экспрессии циркулирующих микроРНК, особенно с использованием их комбинации, имеют большую потенциальную диагностическую ценность для точного и раннего обнаружения опухоли молочной железы [12–14].

В других работах также были установлены многочисленные, специфичные для других видов онкологии циркулирующие микроРНК, которые могут помочь более эффективно выявлять болезнь на ранних стадиях [15, 16 ]. В целом, анализ на микроРНК может использоваться для диагностики практически всех видов этой патологии.

Но и это ещё не всё. Выяснилось, что микроРНК также могут быть эффективно задействованы при диагностике основных возрастных нейродегенеративных патологий, прогресс в лечении которых сегодня наблюдается слабо.

Так, в 2015 году был проведён метаанализ 8 исследований, в которых принимало участие 459 пациентов с нейродегенерацией и 340 здоровых людей в контрольной группе для исследования диагностических показателей циркулирующих микроРНК. Метаанализ подтвердил, что микроРНК могут быть потенциальными биомаркерами в клиническом диагнозе нейродегенеративных болезней, и их диагностическая точность будет лучше с использованием анализа нескольких микроРНК [17].

В 2018 году было опубликовано исследование американских неврологов, в котором были изучены уровни специфических микроРНК в ликворе людей, носителей генетической мутации, связанной с болезнью Хантингтона.

В итоге им удалось обнаружить 6 микроРНК (miR-520f-3p, miR-135b-3p, miR-4317, miR-3928-5p, miR-8082, miR-140-5p), уровни которых начинали показывать рост за 20 лет до ожидаемого появления первых симптомов болезни, что, по словам учёных, увеличивает шансы сделать лечение эффективным и отложить начало заболевания [18].

В других исследованиях были найдены специфичные микроРНК (miR-455-3p, miR-501-3p, miR-26a-5p, miR-181c-3p, miR-126-5p, miR-22-3p, miR-148b-5p, miR-106b-3p, miR-6119-5p, miR-1246, miR-660-5p), позволяющие точнее и на ранних этапах диагностировать ещё одну тяжёлую нейропатологию — болезнь Альцгеймера [19–21].

Также исследования показали, что микроРНК имеют потенциал использования не только при диагностике, но и в качестве терапевтических мишеней при лечении болезней [22, 23]. И это не удивительно — по современным оценкам, экспрессия около 60% человеческих генов напрямую связана с действием микроРНК, и функции большинства из них пока остаются не установленными [24].

МикроРНК показали себя очень чувствительными биомаркерами, позволяющими выявить заболевание на самых дальних подступах, когда ещё никаких симптомов и патологических изменений не видно, что делает их уникальным инструментом в борьбе за здоровое долголетие. И хотя по отношению к микроРНК ещё можно встретить определение «тёмная материя биологии», уже то, что известно сейчас, показывает большие перспективы изучения этих малых молекул.

Источник

Микро рнк что это

В последние годы благодаря молекулярно-биологическим методам раскрыты новые формы рибонуклеиновой кислоты (РНК) — некодирующее семейство РНК (тРНК, мРНК, рРНК, мяРНК), включающее очень короткие некодирующие РНК, называемые «микроРНК» или «miRNA». МикроРНК представляют собой РНК, состоящие примерно из 18—25 нуклеотидов, предшественники которых транскрибируются из генома, затем подвергаются процессам созревания; регулируют экспрессию белков-мишеней, в частности, для специфичных к их мРНК, тем самым ингибируя их трансляцию или вызывая их деградирование. В настоящее время определены более 2000 микроРНК, которые участвуют в регуляции около одной трети генома человека [1]. Это обусловлено, с одной стороны, дерегуляцией клеточной экспрессии микроРНК, наблюдаемой при многих патологиях, характеризующейся увеличением или уменьшением экспрессии, а с другой — способностью клетки секретировать или высвобождать некоторые из микроРНК во внеклеточную среду, что объясняет их присутствие в биологических жидкостях и позволяет предположить, что циркулирующие микроРНК могут представлять интерес как неинвазивные биомаркеры.

Цель исследования — проанализировать знания об использовании микроРНК в качестве биомаркеров (прежде всего в биологических жидкостях) и рассмотреть возникающие перспективы циркулирующих везикулярных форм микроРНК для оценки состояния клеток и тканей, которые их синтезируют.

Аберрантная экспрессия микроРНК

МикроРНК являются посттранскрипционными регуляторами, которые ингибируют продукцию конкретных белков. МикроРНК регулируют экспрессию примерно 1/3 генома и вызывают изменения в основных сигнальных путях и в метаболизме. Таким образом, микроРНК играют существенную роль в различных клеточных процессах, таких как дифференцировка, пролиферация и апоптоз. Если биогенные пути микроРНК аберрантные, они могут стать основными участниками многих патологических процессов. Биологический процесс может регулироваться на нескольких уровнях и приводить к уменьшению или увеличению количества микроРНК в клетке. Эта дерегуляция или аберрантная экспрессия может быть генетической. Таким образом, аберрантная экспрессия микроРНК может проходить путем хромосомной потери (делеция), амплификации, транслокации или даже точечных мутаций генов. Собственные факторы также могут влиять на экспрессию микроРНК. Часто встречаются метилирование остатков цитозина на уровне ДНК (оксирибонуклеиновой кислоты) с гиперметилированием или гипометилированием CpG участков, а также посттрансляционные модификации гистонов у многих видов опухолей. Снижение факторов транскрипции, таких как р53 и c-Myc, также может играть роль в экспрессии микроРНК на уровне промотора. Также могут быть аномалии в белках, происходящие на разных стадиях процесса созревания микроРНК, что нарушает их экспрессию. Это может быть связано с мутациями на уровне процессов связывания с белком Drosha, экспорта микроРНК из ядра в цитоплазму клетки путем экспортина-5 или взаимодействия с ферментом Dicer.

Секреция и высвобождение микроРНК во внеклеточную среду

МикроРНК присутствуют не только в тканях, но и во всех жидкостях организма, таких как кровь (сыворотка и плазма), моча, спинномозговая жидкость (СМЖ) и слюна. Многие из наиболее распространенных микроРНК встречаются в различных типах жидкостей, тогда как другие присутствуют только в специфических. Наличие микроРНК в жидкостях организма было впервые выявлено в 2008 г. Так, микроРНК плацентарного происхождения были обнаружены в материнской плазме [2]. В том же году сообщили об устойчивости циркулирующих микроРНК, и авторы затем поняли потенциал микроРНК в качестве биомаркеров [3]. Синтез микроРНК во внеклеточное пространство в разных формах осуществляют различные механизмы. МикроРНК могут быть секретированы клеткой в виде микроскопических внеклеточных везикул (экзосомы) или микропузырьков (липосомы), высвобождаются в составе апоптотических телец; могут быть обнаружены в виде связанных с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) и большей частью в виде комплексов рибонуклеопротеидов с AGO2 или NPM1 (нуклеофосмин 1). Затем вне зависимости от форм микроРНК переходят от внеклеточного пространства в биологическую жидкость (например, общий кровоток). Около 90% циркулирующих микроРНК находятся в невезикулярной форме, а именно связаны с белками аrgonauts (с AGO2) [4]. Экзосомы — это новая форма межклеточной коммуникации. Это небольшие мембранные везикулы эндосомального происхождения диаметром от 30 до 100 нм. Они секретируются различными типами клеток, нормальными или патологическими, их продукция наблюдается в гемопоэтических клетках (дендритные клетки, B- и T-лимфоциты, тромбоциты), нейронах и глиальных клетках, эпителиальных клетках кишечника и эмбриональных клетках. Опухолевые клетки играют особо важную роль в производстве экзосом. В дополнение к микроРНК экзосомы содержат разнообразный набор молекул, таких как факторы трансляции, ферменты метаболизма, апоптотические белки (Alix), протеолитические белки шапероны (защитные устройства для теплового шока: Hsp70 и Hsp90); содержат другие типы нуклеиновых кислот, таких как мРНК; могут переносить вирусы и прионы из зараженной клетки. Таким образом, ряд конститутивных элементов экзосом могут быть индикаторами происхождения продуцирующей клетки, а также физиологическими или патологическими изменениями, которым клетки подвергаются. Некоторые белки, такие как белки теплового шока (Hsp70 и Hsp90) и трансмембранные белки, такие как тетраспанины (CD9, CD63, CD81, CD82), характерны для экзосом, независимо от типа клеток, которые их производят. Напротив, некоторые белки, в частности мембранные белки, такие как белки клеточной адгезии и протеогликаны, скорее специфичны для клеток, которые их произвели. Это позволяет идентифицировать клеточное происхождение субпопуляций экзосом в биологических жидкостях среди других экзосом. Селективность некоторых молекул, по-видимому, реагирует на сложные механизмы. На микроРНК приходится почти 50% общей везикулярной РНК. Недавно было показано, что их присутствие связано с механизмами сортировки, свидетельствуя о том, что некоторым микроРНК предпочтительней быть в экзосомах [5]. В свое время экзосомы для клетки рассматривали как способ избавиться от ненужного «мусора», например «устаревших» белков. Однако теперь доказано, что эти везикулы больше, чем просто «мусорные ящики», и играют важную роль в межклеточной коммуникации. Экзосомы, таким образом, используются для передачи информации (мРНК, вирусы) и других материалов (белки, микроРНК) из одной клетки в другую (клетка-реципиент). С одной стороны, было показано, что экзосомы, продуцируемые клетками, подвергнутыми стрессу, дают информацию, направленную на индуцирование резистентности окружающих клеток паракринным эффектом. Например, микроРНК регулируют активность b-клеток поджелудочной железы путем переноса экзосом [6]. С другой стороны, оказывается, что экзосомы опухолевых клеток способны дистанционно участвовать в образовании предметастатических «ниш». Экзосомы также играют значительную роль в клеточном иммунитете (представление антигена как иммунного ответа).

Методики анализа экспрессии микроРНК

Микрочипы (microarray). Это миниатюрные системы гибридизации, которые позволяют проводить одновременный высокоуровневый анализ нескольких сотен микроРНК. Этот метод предлагает возможность проведения комбинаторного анализа между микроРНК и экспрессией генов на одном образце, что позволяет изучать функцию микроРНК и целевых генов. Принцип этого метода основан на обратной гибридизации в твердой фазе. Зонды ковалентно связаны с твердым носителем, в то время как микроРНК маркируются и присутствуют в жидкой фазе. Для микроРНК из-за их короткой последовательности нуклеотидов трудно стандартизировать температуры плавления. Эта проблема была решена на некоторых платформах (Exiqon) с использованием модифицированных ядер или LNA (Locked Nucleic Acid), которые включены в зонды гибридизации. Соответствующий выбор LNA уменьшает разницу в температуре плавления между каждым зондом и обеспечивает отличную спецификацию [7]. Более того, благодаря включению LNA в зонды можно дифференцировать микроРНК с очень похожими последовательностями. Однако эффективность экстракции микроРНК из биологических жидкостей намного ниже, чем эффективность, полученная из клеток или тканей, а микрочипы на самом деле не представляют собой метод количественного анализа. Поэтому микрочипы следует использовать для первоначального скрининга, за которым должна следовать индивидуальная валидация интересующих микроРНК с помощью qRT-PCR.

qRT—PCR или ПЦР в реальном времени используется в течение нескольких лет для анализа циркулирующих микроРНК и считается эталонным методом [8]. Преимущество заключается в том, что его можно легко использовать в повседневной практике. Кроме того, он чувствителен, специфичен и предлагает широкий диапазон измерений. С помощью этой технологии возможно выполнить индивидуально для данной микроРНК или в виде панелей из нескольких сотен микроРНК, что требует использования микропланшетов, в которых каждая лунка содержит специфические праймеры для определенных микроРНК. Некоторые специфические свойства микроРНК делают их обнаружение особенно сложными. Действительно, малый размер этих олигонуклеотидов и отсутствие общей последовательности, такой как поли (А) — хвост для мРНК, не позволяют использовать обычные праймеры. Вот почему в соответствии с платформами qRT-PCR используются две категории методов. Они отличаются разработанными праймерами и методами детекции. Первый основан на использовании праймера типа stem-loop для осуществления обратной транскрипции микроРНК. Образованную кДНК затем амплифицируют обычными праймерами (reverse and forward primers), количественно определяют в реальном времени мечеными флуорофорами, которые добавляют к реакционной среде. Этот метод используется в таких платформах, как TaqMan Cards (Life Technologies). Второй включает полиаденилирование микроРНК с использованием фермента: поли (А)-полимеразы Escherichia coli, затем антисмысловой праймер, содержащий последовательность поли (Т), с обеих сторон — универсальную последовательность в 5’-конце и в 3’-конце, что позволяет выполнить действие обратной транскрипции, а затем амплификацию вместе со смысловым праймером. Платформы, такие как Qiagen и Stratagene, используют обычные праймеры, тогда как Exiqon использует праймеры, содержащие LNA-нуклеотиды, что дает им большую специфику. Во всех случаях продукты амплификации обнаруживаются интеркалирующим агентом SYBR Green, чья флюоресценция увеличивается примерно в 100 раз при включении в двухцепочечную структуру. Таким образом, можно достичь абсолютной количественной оценки определенной микроРНК [9].

Трудности в методике, связанные с анализом экспрессии циркулирующих микроРНК

1) Выбор типа образцов, используемых для анализа и преаналитических условий.

2) «Загрязненность» образцов.

3) Отсутствие консенсуса в области стандартизации результатов.

Преаналитические переменные. Если рассматривать среди образцов для исследования циркулирующие микроРНК при различных патологических состояниях, то лучшим выбором будет кровь, а именно плазма или сыворотка. Многие исследователи [10], сравнившие плазму и сыворотку, практически не обнаруживали разницу в количественном определении внеклеточной микроРНК, хотя более высокие концентрации были последовательно обнаружены в сыворотке. Выбор антикоагулянта для сбора плазмы сильно влияет на природу и количество микроРНК [10]. Поэтому выбором среди используемых антикоагулянтов должна стать этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Цитрат и гепарин следует избегать ввиду их ингибирующего действия на ферменты, используемые в qRT-PCR. Объем жидкости для проведения экстракции также может влиять на результаты; поэтому важно, чтобы этот объем был четко описан в протоколе [11]. Гемолиз увеличивает экспрессию некоторых микроРНК, таких как miR-16 и miR-451. Тем более важно учитывать, что miR-16 широко используется для стандартизации результатов. Условия для сбора жидкостей организма, отличных от крови, не были существенно изучены. Выбор скорости и времени центрифугирования зависит, с одной стороны, от запрошенной микроРНК, а с другой — от загрязнений, которые нужно устранить. Фактически, клеточные обломки, апоптотические тельца и тромбоциты крови имеют свои собственные профили экспрессии микроРНК. Когда в качестве биологического материала используют плазму, рекомендуется приготовить плазму, обедненную тромбоцитами, путем двойного центрифугирования с первым центрифугированием крови около 800 g, затем вторым центрифугированием плазмы около 12 000 g для удаления тромбоцитов, которые являются богатым источником микроРНК и могут исказить интерпретацию результатов. Эта глобальная экстракция не отличает различные циркулирующие формы микроРНК и именно поэтому ультрацентрифугирование (110 000 g) или другая более приемлемая процедура (селективное осаждение, ультрафильтрация и т. д.) имеют важное значение для отделения экзосом и микрочастиц. Что касается времени хранения, образцы могут храниться не менее 72 ч при температуре +4 C и в течение нескольких месяцев при –20 °C или –80 °C. Согласно результатам исследования, концентрация некоторых микроРНК снижается при температуре +4 С [12], и предпочтительно замораживать образцы сразу при –80 °С. Эффект циклов замораживания/размораживания носит противоречивый характер и часто приводит к неоднозначным результатам. Несмотря на то что микроРНК, как правило, демонстрируют лучшую стабильность по сравнению с мРНК, существует значительная разница в структуре экспрессии микроРНК в зависимости от условий хранения образцов, а именно неоднородная деградация микроРНК в жидкостях организма. Мы отмечаем, что микроРНК, связанные с везикулярными формами, более стабильны в биологических жидкостях и более устойчивы к РНКазам, чем те, которые не связаны с везикулами. Так как многие микроРНК уникально распределены между невезикулярными и везикулярными формами, это может объяснять разные типы поведения в условиях, которые благоприятствуют механизмам деградации, но последовательность каждой микроРНК, а также структура невезикулярных форм и их ассоциация с их мишенями должны быть важными дифференцирующими факторами [13].Также обнаружено, что ингибиторы РНКаз помогают сохранять невезикулярные микроРНК, защищая самые чувствительные микроРНК от деградации. Эти результаты обнадеживают, поскольку они обеспечивают решением сохранности микроРНК в среде, и позволяют находить новые профили микроРНК в качестве биомаркеров, которые в свое время «избегали» своего обнаружения в силу своей быстрой деградации в биологических жидкостях. В целом, эти элементы необходимо учитывать, чтобы квалифицировать микроРНК как биомаркеры, но проблема устойчивости биомаркеров не рассматривается, например в случае пептидов и полипептидов.

Экстракция микроРНК может быть осуществлена смесью гуанидин тиоцианат/фенол/хлороформа или коммерческими экстракционными наборами, такими как miRNeasy (Qiagen), mirVana (Ambion) и PureLink (Invitrogen). Как и методы анализа, структура экспрессии циркулирующих микроРНК зависит от используемого метода экстракции. Использование фенола в сочетании с ультрафильтрацией на основе спин-колонок обеспечивает хороший выход как общей РНК, так и микроРНК из биологических жидкостей [14]. Состояние голода или поста может влиять на структуру экспрессии микроРНК двумя способами. Во-первых, у некоторых молекул, которые участвуют в транспортировке микроРНК, такие как ЛПВП, ежедневно меняются концентрации в крови. Во-вторых, увеличение уровня липопротеинов после еды препятствует фазе экстракции [15]. Другие преаналитические переменные (такие как возраст, пол, этническая принадлежность, физическая активность, циркадный ритм, использование медикаментов) могут также влиять на результаты [16].

Стратегии нормализации относительной количественной оценки микроРНК. Существуют два метода количественной оценки микроРНК: абсолютное и относительное определение (absolute quantification and relative quantification). Важной задачей является необходимость стандартизировать результаты эндогенными или экзогенными эталонными генами (синтетические олигонуклеотиды), чтобы точно определить уровень экспрессии циркулирующих микроРНК. В отсутствие консенсуса стратегии стандартизации существенно отличаются в разных исследованиях, что делает результаты трудно интерпретируемыми. При относительной количественной оценке значение порогового цикла целевых микроРНК сравнивается со значением контрольных генов. Среди эндогенных генов широко используются RNU6A и RNU6B. Тем не менее они относятся к классу небольших ядерных РНК (snRNAs) со свойствами, отличными от микроРНК. MiR-16 также очень часто используется для стандартизации результатов: он был описан как стабильный и высоковыраженный в крови. Тем не менее гемолиз может изменить скорость, и его экспрессия регулируется в определенных условиях, например при онкологических заболеваниях. Несколько комбинаций микроРНК были предложены в качестве эталонных генов в зависимости от рассматриваемой патологии. Например, комбинация miR-16 с miR-93, по-видимому, является хорошим решением для стандартизации результатов у пациентов с онкологическим заболеванием желудка, а результаты оценки устойчивости экспрессии из 11 контрольных генов на циркулирующие экзосомы показали, что комбинация нескольких микроРНК (miR-221, miR-191, let-7a, miR-181a и miR-26a) наиболее подходит для нормализации специфических серийных микроРНК печени [17]. Среди экзогенных контрольных микроРНК выделяют синтетические микроРНК, принадлежащие Caenorhabditis elegans, такие как cel-miR-39. Использование эндогенных эталонных генов помогает ограничить различия из-за отбора проб, в то время как экзогенные контрольные гены полезны для минимизации изменчивости благодаря аналитическому методу. Поэтому наилучшим решением для стандартизации результатов является комбинация этих двух типов эталонных генов.

МикроРНК как биомаркеры заболеваний. Изучение микроРНК может быть частью дополнительного подхода к исследованию ДНК (генома), мРНК (транскриптома) и белка (протеома). Несмотря на меньшее разнообразие при рассмотрении мРНК или белков, микроРНК в качестве биомаркеров, непосредственно и сильнее связанными с клеточной геномной активностью. Они, в частности, менее глубоко поражены, чем мРНК, посредством некоторых посттранскрипционных модификаций. Кроме того, при сравнении микроРНК и белков, уровень чувствительности, достигаемый для микроРНК, благодаря qRT-ПЦР количественно достаточно высок, чем в настоящее время у белков. Кроме того, в жидкостях организма микроРНК обладают намного лучшей стабильностью, чем мРНК. МикроРНК «спасается» от деградации РНКазами в биологических жидкостях через их транспортные формы, которые включают экзосомы, липосомы и комплексы с белками аrgonautes. В зависимости от формы транспорта (везикулярная или невезикулярная) значение микроРНК как биомаркеров будет различным. Невезикулярные формы могут отражать повреждение и гибель клеток вследствие апоптоза или некроза, характерные для конкретной ткани при исследовании микроРНК, более выраженных в этих тканях. Действительно, некоторые микроРНК имеют довольно сильную клеточную специфичность (например, miR-122 для гепатоцитов или miR-1 и miR-133 для кардиомиоцитов). Везикулярные формы отражают другие процессы. В различных исследованиях показано, что экзосомы являются средством межклеточной коммуникации, позволяющей микроРНК действовать на сигнальные пути клеток, отличных от тех, которые их синтезировали. Профиль микроРНК, содержащихся в экзосомах, частично специфичен для клетки, которая его секретировала и модифицируется в соответствии с физиологическим или патологическим состоянием. Таким образом, опухолевая клетка не будет развивать тот же профиль микроРНК, что и нормальная. Поэтому анализ микроРНК в жидкостях организма может отражать молекулярные изменения, которые происходят в клетках, и предоставлять информацию для оказания помощи в диагностике и принятии терапевтических решений [18]. Однако микроРНК не всегда специфична для клетки или ткани, поэтому наилучшим подходом является анализ микроРНК, которая может быть своего рода «почерком» данной патологии.

При заболеваниях человека различные интересы к биомаркерам не ограничиваются диагностикой или терапевтическим наблюдением. Мы можем ожидать от них преждевременность, позволяющую им прогнозировать появление заболевания еще до проявления его симптомов или его осложнений (подход стратификации риска). Эта характеристика особенно важна при раковых заболеваниях (маркеры агрессии/инвазии или риск метастазов и ответ на лечение).

Поскольку микроРНК участвуют в большом числе патологических процессов, мы не сможем описать все заболевания, при которых микроРНК можно использовать в качестве биомаркеров. Мы решили рассмотреть некоторые текущие применения циркулирующих микроРНК, а также их перспективы в тех областях, где их появление как биомаркеров кажется неизбежным, а именно в онкологии, при сердечно-сосудистых заболеваниях, сахарном диабете, печеночной и почечной патологии.

Онкология

Опухоли являются третьей ведущей причиной смертности в мире после сердечно-сосудистых и инфекционных заболеваний. Все известные причины опухолей так или иначе приводят к изменению ДНК. Поэтому опухоль является фундаментально генетическим заболеванием. Несколько фактов свидетельствуют об участии микроРНК в развитии онкологических заболеваний. Во-первых, около 50% генов, кодирующих микроРНК, обнаруживают в хрупких участках, которые проявляют амплификацию, осаждение или транслокацию последовательностей ДНК при развитии опухоли. С другой стороны, опухолевые изменения, вызванные гиперметилированными или гипометилированными областями, имеют последствия для транскрипции генов микроРНК. Тем не менее микроРНК регулируют экспрессию многих генов, кодирующих белки (либо проонкогенные микроРНК, либо опухолевые супрессоры), отсюда и их название «oncomiR». Недавно было показано, что гипоксия, сопровождающая процесс с высокой пропускной способностью, ингибирует синтез ферментов DROSHA и DICER, что уменьшает общий пул микроРНК, тем самым способствуя росту и развитию опухоли с появлением метастазов [19]. Кроме того, существует много взаимодействий между функциями микроРНК и основными путями онкогенеза. Поэтому микроРНК можно использовать в качестве опухолевых маркеров для скрининга, диагностики, классификации и прогнозирования, а также для наблюдения за терапевтическим эффектом. Первое использование микроРНК в качестве биомаркеров в области радиологии относится к 2008 г., когда обнаружили потенциальную роль miR-21 в диагностике и прогнозе диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы [20]. С тех пор число описанных в экспериментальных работах микроРНК, которые могут быть использованы в качестве биомаркеров опухолей, растет. За последние несколько лет известность понятия «жидкостная биопсия» значительно возросла. Она включает исследования биологических жидкостей опухолевой ДНК, опухолевых клеток и микроРНК [21]. Есть два основных преимущества. Во-первых, эти исследования неинвазивны, во-вторых — можно следить за эволюцией кинетики этих маркеров во время терапии.

Рак молочной железы. Рак молочной железы — ведущая онкологическая патология в женском организме. MiR-137 и miR-138 регулируют активность KDM5 — гистона метилазы, который контролирует рост и миграцию клеток рака молочной железы [26]. MiR-21 также вмешивается в процессы пролиферации и миграции раковых клеток путем ингибирования гена Smad7 через сигнальные пути как эпидермальный фактор роста (EGF) и трансформирующий фактор роста-β (TGF-b) [27]. Анализ на микрочипе когорты из1280 образцов сыворотки пациентов с раком молочной железы из Национального онкологического центра Biobank (NCCB) по сравнению со здоровыми субъектами и пациентами с другими видами опухолей показал интерес к комбинации пяти микроРНК (miR-1246, miR-1307−3p, miR-4634, miR-6861−5p и miR-6875−5p) в раннем выявлении данной патологии [28]. Циркулирующие микроРНК могут также иметь прогностическую ценность. Действительно, в недавнем исследовании было предложено, что группа из четырех микроРНК может быть предиктором рецидива и общей выживаемости у пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы (ТНРМЖ) [29]. Последнее связано с отсутствием гормональных рецепторов эстрогена, прогестерона и отсутствием чувствительности рецептора HER-2. Тройной негативный рак молочной железы составляет почти 15% от рака молочной железы и связан с более негативным прогнозом.

Рак предстательной железы. Рак предстательной железы — наиболее часто диагностированная злокачественная опухоль у мужчин и вторая ведущая причина смертности после рака легких. Результаты экспериментальных исследований на мышах показывают, что сопутствующее снижение экспрессии miR-15 и miR-16 связано с увеличением уровней miR-21 в процессе рака предстательной железы, который активирует путь TGF-b, способствуя метастазированию в костную систему и остеолизу путем инвазии раковых клеток [30]. Использование четырех эндогенных микроРНК для диагностики рака предстательной железы показало положительную прогностическую ценность (PPV) 80%. Среди этих микроРНК let-7a, который является опухолевым супрессором и miR-141, который является проонкогеном [31]. Концентрации miR-107 и miR-574−3p также намного выше в моче у пациентов с раком предстательной железы, чем у здоровых мужчин [32].

Колоректальный рак. В мире колоректальный рак занимает одну из ведущих позиций. В нескольких исследованиях была также установлена роль микроРНК в патогенезе данной опухоли, что может быть использовано для раннего скрининга. Таким образом, в одной из экспериментальных работ был проанализирован уровень экспрессии микроРНК в плазме у 103 пациентов с колоректальным раком и у 37 контрольных субъектов, где аберрантная miR-221 дифференцирует две группы с чувствительностью 86% и специфичностью в 41% [33]. MiR-29a и miR-92a также имеют диагностическое преимущество для этого рака, при этом чувствительность составляет 73%, а специфичность — 79% [34]. MiR-92 была подтверждена у 180 участников, включая 90 пациентов с колоректальным раком, 20 пациентов с раком желудка, 20 пациентов с воспалительным заболеванием кишечника и 50 контрольных субъектов для дифференциации колоректального рака от рака желудка [35]. Кроме того, циркулирующие микроРНК могут использоваться для прогнозирования или идентификации пациентов с высоким риском рецидива. Действительно, увеличение miR-141 в плазме связано со значительным риском метастазов и плохим прогнозом, тогда как miR-29-c предсказывает ранний рецидив [36, 37].

Опухоли центральной нервной системы. В последние годы в ряде исследований также выявлена потенциальная роль циркулирующих микроРНК как биомаркеров для опухолей ЦНС. Таким образом, с помощью этих микроРНК можно дифференцировать первичные опухоли головного мозга от метастазов и других опухолей. Например, miR-9, который высоко экспрессируется в головном мозге, обнаруживается в опухолях ЦНС и отсутствует в других опухолях [38]. Глиобластомы являются наиболее агрессивными и смертельными первичными опухолями ЦНС, поэтому первостепенное значение имеет поиск биомаркеров для ранней диагностики, улучшения общей выживаемости пациентов и снижения риска рецидива опухоли. Как и в случае других патологий, были изучены циркулирующие микроРНК при глиобластомах. Среди всех микроРНК miR-21 имеет особое значение, являясь одной из наиболее активных микроРНК в глиобластомах. Было обнаружено, что изначальная сверхэкспрессия экзосомальных форм miR-21 в сыворотке у пациентов с глиобластомами снижается после обширной резекции опухоли [39]. Таким образом, экспрессия miR-21, связанная с экзосомами, может служить платформой для развития биомаркеров высокозлокачественных глиом. Медуллобластома является наиболее распространенной опухолью ЦНС у детей. Снижение экспрессии нескольких микроРНК в крови, таких как miR-124, miR-125 и miR-9, отмечали при прогрессировании опухоли, что доказывает их роль в остановке роста медуллобластомы, а также в их использовании в качестве биомаркеров для данной патологии [40].

Сердечно-сосудистые заболевания

Циркулирующие микроРНК являются привлекательными кандидатами для мониторинга сердечно-сосудистых заболеваний. Предполагается, что изменения экспрессии микроРНК в жидкостях организма происходят раньше, чем ныне известных обычных биомаркеров (например, маркеров воспаления и восстановления в сердечно-сосудистой системе, которые включают тропонин, С-реактивный белок, хемокины и цитокины). Однако к тому моменту, когда эти белки обнаруживают в крови, значительная часть повреждения тканей уже произошла, что делает циркулирующие микроРНК крайне важными, так как они играют свою роль еще задолго до этого момента. Это подразумевает использование микроРНК для более раннего скрининга. МикроРНК участвуют в регуляции и функционировании сердечно-сосудистой системы. Ряд из них обнаруживают при сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как инфаркт миокарда, атеросклероз сосудов, сердечная недостаточность, фибрилляция предсердий, гипертрофия, сердечный фиброз; при инсульте. Атеросклероз отвечает за большинство сердечно-сосудистых заболеваний. Он характеризуется отложениями липидов и волокнистых элементов в стенке артерий. Образование этой атероматозной бляшки является результатом взаимодействия между иммунными клетками, гладкомышечными клетками и сосудистым эндотелием. МикроРНК регулируют функции этих клеток, а также метаболизм холестерина. Некоторые микроРНК, такие как miR-155, могут усугубить ранние стадии атеросклероза, стимулируя воспалительный ответ и поглощение липидов макрофагами. И наоборот, другие микроРНК, такие как miR-126, обладают антиатерогенным действием [41]. Инфаркт миокарда представляет большую опасность для жизни, поэтому важно найти маркеры для ранней его диагностики. При изучении профиля экспрессии микроРНК с помощью qRT-PCR показано объективное увеличение количества циркулирующих микроРНК, таких как miR-499, miR-208b, у 32 пациентов с инфарктом миокарда, по сравнению с 36 здоровыми людьми, что позволило диагностировать инфаркт миокарда с хорошей чувствительностью и хорошей специфичностью в течение 4, 8, 12, 24 и 72 ч после сердечно-сосудистого события [42, 43]. Кроме того, miR-133a и miR-208b связаны с риском смертности вследствие острого коронарного синдрома, что делает их потенциальными прогностическими маркерами [44].

Заболевания печени

Печень является центральным органом метаболизма и объектом многочисленных атак вирусов, алкоголя, наркотиков и других ксенобиотиков. MiR-122 — наиболее распространенная микроРНК в ткани печени, где она представляет более половины микроРНК, выраженных в этом органе; кроме того, печень является почти единственным органом с проявлением экспрессии miR-122. Эта микроРНК участвует во многих физиологических и патологических функциях, таких как регуляция липидного обмена и подавление опухолевого процесса. Клинические испытания экспериментального препарата миравирсена, который является ингибитором miR-122 (или другими словами «Antagomir») у пациентов с гепатитом C показали снижение вирусной РНК, подтверждая роль miR-122 в развитии этого заболевания [45]. При поиске новых неинвазивных биомаркеров при qRT-PCR-анализе плазмы у 83 пациентов с гепатитом B, у 15 пациентов с заболеваниями скелетной мускулатуры и у 40 участников контрольной группы miR-122 показала себя как хороший неинвазивный маркер повреждения печени вирусами, алкоголем и химическими веществами [46].

Болезни почек

Оценка скорости клубочковой фильтрации необходима для классификации почечной недостаточности, а также для корректировки дозы препаратов и времени почечной элиминации. В настоящее время нет идеального маркера для оценки функции почек, а формулы для расчета клиренса креатинина имеют множество ограничений. Несколько микроРНК экспрессируются в почках и контролируют рост, миграцию и структуру почечных клеток. Изменения в некоторых из этих микроРНК связаны с почечной патологией. Например, уменьшение экспрессии miR-30 сопровождается уменьшением числа почечных клеток, нарушением артериального давления, развитием сосудистых поражений и обширным фиброзом [47]. Анализ микроРНК в образцах мочи у 56 пациентов с хронической почечной недостаточностью, подвергшихся биопсии, показал, что экспрессия miR-21 и miR-216a коррелирует с клинической функцией и риском прогрессирования диализ-зависимой острой почечной недостаточности [48]. Таким образом, профиль экспрессии микроРНК в моче может быть неинвазивным маркером функции почек. Поскольку исследования ограничены небольшими сериями, необходимы более широкие наблюдения для подтверждения этого. Анализы микроРНК мочи также могут б

Источник