Молекулярная диагностика что это
Молекулярная диагностика рака
Молекулярно-генетическое тестирование является неотъемлемой частью обследования и лечения онкологических больных во всем мире.
Анализ опухоли каждого конкретного пациента и формирование индивидуального перечня потенциальных молекул-мишеней стало возможным благодаря внедрению методик молекулярно-генетического анализа в клиническую практику. Научная лаборатория молекулярной онкологии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова выполняет полный спектр современных молекулярно-генетических исследований для онкологических пациентов и их родственников.
Кому и чем могут помочь генетические исследования?
НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова осуществляет полный комплекс мероприятий, связанных с диагностикой наследственной предрасположенности к раку молочной железы.
Любой человек является носителем каких-то мутаций, опасных либо для нас, либо для потомства. Первое направление исследований онкогенетиков – выявление наследственных мутаций с помощью секвенирования генома. Второе направление – исследование собственно опухоли, спектра приобретенных клеткой мутаций, в связи с которыми она возникла. Для этого тоже требуется исследование генома всего организма, чтобы сравнить последовательность ДНК опухоли с последовательностью ДНК в организме. Поэтому в будущем оно потребуется для лечения любой опухоли.
Подробнее узнать о деятельности Лаборатории молекулярной онкологии здесь.
Подробнее узнать о Группе молекулярно-генетических методов исследований референс-центра по ссылке.
Молекулярная диагностика
Чем лучше ученые понимают человеческий геном, тем большую роль в подходе к злокачественным заболеваниям играет молекулярная диагностика и исследование генетических аномалий. По сути дела, такое изменение концепции рака радикально меняет подходы к диагностике, позволяя грамотнее и точнее определять стратегии лечения. Благодаря молекулярной диагностике становится возможной ранняя постановка диагноза и выстраивание скорректированной схемы лечения, обеспечивающей более благоприятный исход для пациентов со злокачественными новообразованиями.
Что такое молекулярная диагностика
Молекулярная диагностика (MDx) – раздел диагностических исследований in vitro, включающий все специфические методы анализа нерегулярных биополимеров – ДНК, РНК и белков. MDx является основой персонализированной медицины.
Особенности и цели молекулярной диагностики
Суть молекулярной диагностики – в понимании аберраций гена конкретного пациента. Необходимость точного описания подобных нарушений возникла во многом благодаря развитию таргетной терапии и появлению таргетных препаратов, то есть препаратов, которые воздействуют непосредственно на молекулярную «мишень» (отсюда и название препаратов от английского target – мишень) в опухоли.
Молекулярная диагностика преследует несколько целей. Наиболее важными из них являются:
Молекулярная диагностика считается дорогостоящей процедурой по сравнению с другими методами исследования. Полученный диагноз является более точным, поскольку способен сообщать об изменении того или иного заболевания и влиянии этого изменения на организм, тем самым определяя эффективность лечения.
Молекулярные методы используются не только для диагностики различных заболеваний, но и для оценки реакции на лечение, особенно у онкологических больных. Они являются одним из наиболее эффективных методов отображения развития и рецидива заболеваний.
Наличие или отсутствие определенных соматических мутаций для тех или иных видов рака позволяет не только дать точный прогноз по этим опухолям, но и выбрать правильные препараты. Так, для лечения опухолей толстой кишки необходимо анализировать мутации в генах KRAS и BRAF. При раке молочной железы следует обратить внимание на гены BRCA1 и BRCA2. Понимание связи генных мутаций и специфики заболевания – необходимое звено в лечении онкозаболеваний.
Методы молекулярной диагностики
Одним из самых актуальных методов молекулярной диагностики стал метод аллель специфичной ПЦР в реальном времени. Благодаря этому методу выявляются мутации в генах EGFR, KRAS, BRAF, PI3K, MGMT, UGT1A1. На основании полученной информации выстраивается схема лечения и контролируются результаты терапии.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это молекулярный метод, в котором фрагмент генетического материала, будь то ДНК или РНК, амплифицируется для выявления мутаций и подтверждения предполагаемого диагноза.
Этот метод имеет лабораторной молекулярной диагностики ряд особенностей:
Полученную смесь помещают в термоциклер – аппарат, действующий путем изменения температуры, указанной специалистом в соответствии с исследованием, амплифицируя генетический фрагмент.
В случае обычной ПЦР продукт после амплификации подвергается электрофорезу, представляющему собой молекулярный метод, основанный на весе и размерах фрагментов. В соответствии с этими свойствами создается образец связок, анализ которых проводится в связи с полосой положительного контроля, т. е. в полосе, которая, как известно, соответствует генетическому изменению.
ПЦР в реальном времени (qPCR) является разновидностью количественной полимеразной цепной реакции, т. е. помимо выявления генетического изменения, она также может давать информацию об экспрессии генов (о том, насколько сильно измененный ген выражается в организме, и, таким образом, может использоваться для диагностики и мониторинга лечения).
Молекулярный метод «нового поколения» NGS (секвенирование) определяет нуклеотидную последовательность ДНК. Исследование проводится с помощью ПЦР-подобной реакции, однако в амплификационную смесь добавляются модифицированные нуклеотиды (фторохромы), поэтому при амплификации материала модифицированные нуклеотиды встраиваются в ДНК и создают несколько фрагментов, соответствующих продукту секвенирования. Продукт реакции помещают в аппарат – ДНК-секвенсор. На основании полученного результата врач диагностирует генетические заболевания.
Преимущества клиники молекулярной диагностики «Медскан»
Клиника «Медскан» предлагает все новейшие методы молекулярной диагностики, в том числе ПЦР, FISH, цитогенетику. В качестве комплексного высокопроизводительного прогностического и диагностического молекулярно-генетического метода активно внедряется в практическую медицину секвенирование. Сегодня уже доступны полноэкзомные и полногеномные исследования, а также различные таргетные панели для NGS.
В центре молекулярной диагностики используется современное оборудование экспертного класса для проведения анализов. Специалисты с большим практическим опытом периодически повышают уровень квалификации и четко следуют международным протоколам. Цены на молекулярную диагностику в Москве уточняйте по телефону, указанному на сайте.
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»
Потехин О.Е., к.м.н.
Целью любого лабораторного анализа является идентификация и определение концентрации искомого вещества. В современной медицине для этого широко используются методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК. К иммунологическим методам в первую очередь относят иммуноферментный анализ (ИФА). В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Эти распространенные методы широко используются для определения антител, антигенов, ДНК.
Открытие ИФА и ПЦР стало возможно благодаря ряду открытий в области иммунологии и молекулярной биологии в 60-80-годы прошлого века.
ИФА — метод выявления антигенов или антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет:
В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Е. Энгвал и П. Перлман для детекции IgG фракции иммуноглобулинов, К. Ван Веемен и А. Шурс для обнаружения эстрогенов.
Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики.
Для ферментативной метки коньюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза и др. В качестве субстратного реагента также применяются разнообразные хромогенные вещества, продукты окисления которых как раз и регистрируются фотометрически при определенных длинах волн (волновой диапазон 340-750 нм).
Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа.
В 1972 г. К. Рубенштейн с сотр. разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.
Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.
Основной принцип ИФА – специфическое связывание антитела с мишенью. Для получения антител первоначально использовали иммунизацию животных (обычно кролика) очищенным белком. Однако в этом случае получали смесь антител к разным антигенным детерминантам молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлонильным препаратом. Использование поликлональных антител имело два существенных недостатка: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различать сходные мишени, т.е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой.
Этим объясняются многочисленные «перекрестные» положительные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам.
Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег.
Благодаря разработке метода получения моноклональных антител (МАТ) с помощью техники гибридом стало возможно получение препаратов антител к одной антигенной детерминанте.
С.Мильштейн и Г.Келер за разработку техники получения гибридом, вырабатывающих МАТ с запрограммированной специфичностью, получили в 1984 году Нобелевскую премию в области медицины и физиологии. Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму. В основу метода положен давно известный принцип гибридизации (слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов. Первые — плазмоцитомы (опухолевые плазмоциты) из линий, культивируемых в искусственных условиях, invitro. Как и все злокачественные клетки они интенсивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки —иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней.
Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих «родителей».
К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов.
Преимущества МАТ:
По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы. Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты.
Еще одним из важнейших современных методов диагностики заболеваний внутренних органов является ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции.
ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР – это «in vitro» аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке.
ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов. В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции.
Открытию полимеразной цепной реакции сопутствовало развитие молекулярно-биологических технологий.
Первые данные о химических своиствах ДНК появились в 1868 г. К началу 50-годов ХХ в. было установлено, что ДНК – это линейный полимер, состоящий из нуклеотидов, состоящие из азотистого основания, пентозы и фосфатной группы. Основания бывают двух типов: пуриновые – аденин и гуанин и пиримидиновые – цитозин и тимин.
В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух комплиментарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Согласно модели Уотсона навитые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин – с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой (растущей цепи) задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. В 1955 г. А. Корнберг открыл в клетках фермент, который назвал ДНК-полимеразой. ДНК-полимеразы обеспечивают репарацию и репликацию ДНК.
Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3′-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т. е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков).
В 1962 г. американские ученные Дж.Уотсон, Ф.Крик и М.Уилкинс получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и ее роли в передаче информации в живой материи.
В 1971 г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако возможность использования ПЦР в плане наработки огромного количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Возможно, это было связано с техническими трудностями связанными с необходимостью трудоемкого синтеза праймеров.
В 70-х годах были открыты специальные ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, которые расщепляют ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность «разрезать» ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом стало проще выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами.
В начале 80-х годов проблема с синтезом праймеров была разрешена благодаря разработке автоматических синтезаторов ДНК.
В 1966 г. был открыт новый вид термофильной бактерии Thermusaquaticus (Taq), содержащий термостабильную Taq-ДНК-полимеразу. К. Мюллис в 1983-1984 гг. провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первый начал использовать Taq-ДНК-полимеразу вместо ранее использовавшейся неустойчивой к высоким температуры ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис совместно с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.
Результатом открытия ПЦР стало немедленное практическое использование метода. В 1985 г. была опубликована статья, в которой была описана тест-система для диагностики серповидно-клеточной анемии на основе ПЦР. Начиная с 1986 г. К настоящему времени ПЦР посвящено более 10000 научных публикаций. Перспективы использования ПЦР представляются более чем впечатляющими.
В заключение хотелось бы сказать, что создатели любого диагностического метода должны стремиться к тому, чтобы он был: высокоспецифичным; высокочувствительным; достаточно простым и позволяющим получать однозначные результаты; иметь приемлемую стоимость исследования. ИФА и ПЦР сочетают эти качества в высокой степени.
У каждого болезнь своя
В настоящий момент «золотым стандартом» в онкологии является гистологическое исследование. Оно позволяет выделить отдельные формы, типы и подтипы опухолей, прогнозировать развитие каждой из них по отдельности, определить тип лечения. Однако с развитием методов диагностики появилась возможность более глубокого изучения опухоли и определения ее молекулярных характеристик, что позволило более четко стратифицировать типы онкологических заболеваний. Произошел сдвиг парадигмы от лечения типа онкологического заболевания к лечению конкретного пациента и конкретной опухоли. Принцип, учитывающий особенности каждого пациента, лежит в основе персонализированной медицины, которая находит свое дальнейшее развитие в т.н. прецизионной, то есть точной медицине (precision medicine). Ее отличие в том, что при выборе лечения используется информация о полном наборе молекулярных изменений в клетке.
Генетический портрет опухоли
Прежде онкологи имели лишь узкий набор биомаркеров с относительно доказанной эффективностью. С появлением и развитием молекулярно-генетических тестов онкодиагностика вышла на новый уровень. Сегодня есть арсенал методов, которые позволяют выявлять молекулярные нарушения на любом уровне функционирования опухолевой клетки, будь то изменение в структуре или последовательности ДНК, изменение в составе белков или в процессах метаболизма.
Наиболее широко применяемым методом является определение мутаций и перестроек в последовательности ДНК. Методы их определения непрерывно совершенствуются, в клиническую практику входят более чувствительные и высокопроизводительные, их высокая точность дает возможность определять даже редкие мутации и проводить анализы крови (жидкостная биопсия).
Еще 20 лет назад нам был доступен просмотр только одного гена за один тест, на это уходило около двух дней. Сейчас появилась возможность проводить полную оценку генетического портрета опухоли за 2-5 дней и накапливать эти данные для дальнейшего анализа. Технология секвенирования нового поколения (NGS) позволяет «прочитать» одновременно сразу несколько участков генома, что наряду с высокой чувствительностью является главным отличием от более ранних методов. Поэтому на сегодняшний день NGS является основным методом, применяемым в современных исследованиях и создании баз данных. Такие базы данных в дальнейшем используются для выявления новых клинически значимых мутаций, уточнения их роли в патогенезе опухоли и влиянии на ее характеристики.
Решение для каждого
Использование новых методов диагностики и анализа данных позволяет четко выделять группы пациентов, у которых будет эффективна именно инновационная терапия. Комплексное геномное профилирование позволяет выявить потенциальные мишени для всех разрабатываемых в мире препаратов и, если возможности стандартных схем исчерпаны, выработать индивидуальную схему лечения. Применение метода с заранее известной эффективностью значительно снижает стоимость лечения онкологических пациентов в целом.
Несмотря на преимущества новых методов молекулярной диагностики, далеко не всегда они применяются в рутинной практике. Для их внедрения требуется множество сравнительных и подтверждающих исследований. Сегодня в большинстве национальных медицинских исследовательских центров России есть вся необходимая инфраструктура для их проведения. Появились и готовые решения как российских, так и зарубежных производителей для проведения комплексного геномного профилирования в различных областях медицины, в частности в онкологии. Следующим шагом является их апробация в клинической практике и внедрение в качестве медицинских услуг. Ключевой задачей на сегодня является валидация разработанных методов и сопоставление с существующими подходами.
Широкое внедрение методов молекулярной диагностики позволит существенно повысить эффективность терапии и качество жизни онкологических пациентов, а также сократить общие затраты на лечение.
Нельзя друг без друга
Развитие персонализированной медицины невозможно без взаимодействия между медицинскими центрами, лабораториями и фармкомпаниями. Эта тенденция наблюдается во всем мире. В частности, многие исследования по определению риска рецидива онкологических заболеваний и молекулярному профилированию проводятся именно в сервисных лабораториях. Такого рода партнерства позволяют медицинским учреждениям осуществлять высококачественную диагностику даже при отсутствии собственной инфраструктуры. Взаимодействие с фармкомпаниями обеспечивает наиболее быстрый доступ к современным препаратам (таргетная терапия, иммунотерапия). А также позволяет наиболее точно формировать цели для будущих исследований и поиска новых препаратов.
С развитием фармацевтики молекулярная диагностика становится все более и более важной сферой, которая определяет, какой препарат и почему будет показан пациенту и обеспечит эффективность его лечения. Но без диагностики препарат будет бесполезен. Разрабатывая и выпуская на рынок новейшие препараты таргетной и прецизионной медицины, производитель все больше будет зависеть от развития диагностики. И все чаще будет опираться на них при выпуске новых лекарств. В онкологии дальнейшее развитие, безусловно, будет идти именно в этом направлении. Соответственно, должны формироваться механизмы регистрации, оценки и применения подобных инновационных решений.
Виктория Морецкая, руководитель отдела молекулярно-генетической диагностики компании «Рош Москва»:
— Рациональным диагностическим решением является комплексное геномное профилирование (КГП) опухоли с выявлением всех клинически значимых изменений. Оно предполагает выбор наиболее эффективной терапии, что, в свою очередь, может отсрочить прогрессирование заболевания. Активное внедрение КГП в рутинную онкологическую практику может оказать существенное влияние на снижение смертности от злокачественных новообразований, что поможет достичь целевых показателей эффективности онкологических служб субъектов Российской Федерации.
Дмитрий Власов, медицинский директор компании Bayer:
Алексей Шавензов, директор по взаимодействию с государственными органами власти компании «Джонсон&Джонсон»:
— Сегодня инновационные технологии в здравоохранении развиваются настолько стремительно, что существующие регуляторные системы вскоре могут оказаться не готовы к их принятию. Терапевтическая медицина двигается по пути персонификации. Унифицированные регуляторные механизмы (например, проведение локальных клинических исследований на популяции или экспертиза качества препарата в лаборатории регуляторных органов) могут быть неприменимы для таких индивидуализированных решений, как генетически модифицированная аутологичная Т-клеточная иммунотерапия. Работа по созданию современного российского регуляторного пространства в отношении подобных инноваций должна проводиться заранее, в тесном сотрудничестве с профессиональным сообществом и с учетом уже накопленного международными регуляторными агентствами (такими, как FDA и EMA) опыта.
Сергей Андреев, директор по лабораторной диагностике «АстраЗенека», Россия и Евразия:
Основой современного подхода к лечению онкологических пациентов является применение «таргетных» препаратов. Более 70 процентов новых лекарственных препаратов для назначения требуют выявления молекул-мишеней, и лабораторная диагностика требует все более современных методов. Генетическими маркерами для назначения «таргетной» терапии являются наследственные или опухолевые (соматические) мутации. В силу требований к сертификации и регистрации тест-систем, клинические лаборатории проводят исследование стандартных мутаций методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выявление расширенного спектра мутаций методом геномного профилирования (NGS) позволяет расширить количество пациентов с высокими шансами на излечение. Панели, объединяющие в себе десятки генов, связанных с заболеваниями, анализируют в крупных лабораториях, имеющих лицензию для научных исследований, однако в стандартной клинико-диагностической лаборатории такая услуга пока не доступна. Регистрация высокотехнологичного оборудования и панелей для анализа генов в Росздравнадзоре ведется, однако процедура новая, и требует принятия нестандартных решений, также как и внесение данной услуги в стандарты оказания медицинской помощи и в ОМС.