На чем основана люминесцентная микроскопия
Как работает люминесцентная микроскопия
Люминесцентная микроскопия — исследование, связанное со свечением объектов. Большинство из них не видны, т.к. используется ультрафиолетовое излучение. В некоторые образцы добавляют красители, взаимодействующие с соединениями.
Краткая историческая справка
Флуоресценцию открыл Джордж Стокс в 1852 г. Английский физик наблюдал ее у хининовых веществ. Позже ученые выяснили, что облучение ультрафиолетом приводит к свечению многих соединений. Флуоресценция характерна для витаминов, кристаллов, горных пород, масел и хлорофилла. Однако полученные сведения применили позднее.
Применение флуоресценции позволило изучать микрообъекты с разрешением от 1 до 10 нм. Наноскопия может раскладывать частицы на отдельные молекулы.
Что такое люминесцентная микроскопия
При физическом процессе соединения поглощают фотоны. Одновременно у веществ появляется излучение с иной длиной волны. У получившихся фотонов она больше, но энергии меньше. Когда соединения облучают ультрафиолетом, отдельные из них светятся. Цвет излучения направлен к красной спектральной части.
Люминесцентные устройства функционируют в отраженном свете. Основной задачей при применении флуоресценции является отделение потока света объекта от сильного излучения подсветки. Чтобы увеличить наглядность изображения, используется темный или черный фон.
Методы исследования
В люминесцентной микроскопии применяются различные методы исследований. Микробиологи используют флюорохромирование и реакцию иммунной флуоресценции. Вторую часто называют также методом флуоресцирующих тел.
Существует другой вид изучения молекул — конфокальная микроскопия. Она дает возможность исследовать частицы на той или иной глубине.
Флюорохромирование
Метод является распространенным в исследовании органов и тканей человека. Вторичную люминесценцию получают, обрабатывая образцы флюорохромами. Каждый предназначен для каких-либо целей.
Акридиновый оранжевый применяется для диагностики раковых заболеваний и инфаркта на ранних сроках. Ишемические участки имеют зелено-желтое свечение. Флюорохром применяют, чтобы выявлять кислые мукополисахариды. Если он взаимодействует с ДНК, появляется зеленая флуоресценция. Для реакции красителя на РНК характерна красная.
Кофеин 5 и родамин применяются для определения гликогена в печени. Фосфин 3Р — для выявления липидов. Аналогичными свойствами обладает смесь растворов бензпирена и кофеина. Второй должен быть насыщенным. При наличии липидов появляется бело-голубая люминесценция.
Тиофлавин окрашивает особые белковые соединения при амилоидозе. Для него характерно зеленое свечение. При такой болезни внутренних органов в них образуются амилоиды.
Морин используют для определения содержания кальция в тканях. После обработки спиртовым раствором образцы имеют зеленую люминесценцию.
Черный солохром применяют для выявления алюминия. Он сопровождается желто-оранжевым свечением.
Родамин 6Ж необходим для определения сурфактанта в тканях легких. На его наличие указывает оранжевая люминесценция.
Реакция иммунной флюоресценции
Благодаря методу флуоресцирующих тел выявляют антитела, гормоны, продукты метаболизма и др. Реакция иммунной флюоресценции определяет рак и инфекции на ранних стадиях. Возможности таких исследований расширило развитие иммунохимии. Сейчас небелковые соединения в тканях выявляют искусственными гаптенами.
Особенности исследования отдельных молекул и микроорганизмов
В теории можно сделать изображение какой-либо молекулы, используя оптические устройства, красящие вещества, ультрафиолет и светофильтр. Объект исследования должен флюоресцировать на темном фоне, а остальные частицы нет. Их цветовое значение близко к нулю.
Детектор микроскопа распознает не только излучение нужной молекулы, но и реагирует на иные фотоны. Они попадают на люминесцентное устройство от других источников света.
Сейчас для детального анализа образца применяют оптико-механические приборы и электронно-вычислительную технику. С помощью современного программного обеспечения ее подключают к монитору. На него выводится трехмерное изображение. После получения информации о координатах новых частиц компьютер микроскопа запоминает их расположение. Они исчезают с экрана.
Получить изображение объекта легко с помощью оптики, дополнительной техники и ПО. Качество снимка будет ниже, чем при применении люминесцентного устройства. Иногда для наблюдений такой способ допускается, т.к. не всегда требуется сверхвысокое разрешение.
Для осуществления наблюдения понадобятся:
Сфера применения люминесцентной микроскопии
Флюоресцентный микроскоп незаменим в биологии, медицине, а также смежных областях. Он позволяет проводить точные исследования клеток и тканей организмов. Главным преимуществом люминесцентной микроскопии считается возможность увидеть образец изнутри. Остальные приборы изучают лишь поверхность объекта.
Флюоресцентные устройства часто используют криминалисты. Они сравнивают образцы тканей и веществ для установления их принадлежности. Свечение применяется в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Оно помогает выделять бактерии и клеточные структуры из-за способности взаимодействовать лишь с нужными красителями.
Явление флуоресценции открыли в 1852 г., но громоздкие микроскопы имели плохое разрешение. Новейшие технологии позволяют использовать люминесцентные ферментные метки, делающие устройства компактными. Их разрешение обладает высоким качеством.
Метод люминесцентной микроскопии является незаменимым для:
Применение эффекта свечения нужной длины волны у молекул помогает распознать вирусы и бактерии с высочайшей точностью.
Другие микроскопы выявляют только наличие инфекции. Благодаря разрешению 1 нм получают четкие и яркие изображения.
Принцип работы люминесцентного микроскопа
Принцип работы устройства заключается в испускании излучения объектом исследования вслед за светом возбуждения — электромагнитной волной с ультрафиолетовым диапазоном. Иногда используются зеленые или синие лучи. Они являются видимыми.
В микроскоп устанавливают зеркало, направляющее на исследуемый образец поток света. Его источником является ксеноновая или ртутная лампа. Отдельные лучи поглощаются материалом, остальные отражаются и направляются в пространство. Под ним подразумевается и глаз человека. Отраженное свечение источника забирает слабое излучение — собственное свечение микрообъекта. Для его отделения от ультрафиолета перед линзами устройства размещают светофильтр. Он отсекает лучи с более короткой электромагнитной волной.
Люминесценция отличается двойственным происхождением.
Большинство веществ светятся самостоятельно из-за воздействия ультрафиолетовых лучей. В других случаях к образцам добавляют флюорохромы.
Преимущества люминесцентной микроскопии
Люминесцентная микроскопия имеет множество достоинств. Основным является возможность изучения живых клеток и микроорганизмов. Исключается опасность их соединения или окрашивания, что провоцирует гибель. Поэтому ученые могут:
Пример наглядности результата
Ярким примером служит изучение глиальной ткани человеческого мозга с помощью оптического и фазово-контрастного устройства. При сравнивании изображения выводы может сделать любой человек, не имеющий специальных знаний.
При применении оптического микроскопа клетки мозга выглядят прозрачными. Можно увидеть только части, имеющие выраженное преломление, к примеру мембрану или ядро. Полученная картинка не подходит для подробного изучения образца.
При использовании метода фазового контраста детали хорошо различимы. На четком изображении видны мельчайшие клеточные структуры и места их соединения друг с другом.
Как интерпретировать
Образцы, окрашенные флюорохромами, рассматривают, увеличивая в 200-630 раз. Однако чаще используется значение 400. При изучении препаратов после обработки карболовым фуксином изображение увеличивают в 1000 раз. Поэтому поле зрения объектива на люминесцентном микроскопе намного больше, чем простом.
Например, при диагностике туберкулеза методом флуоресцентной микроскопии есть свои тонкости. Приводится рекомендуемое количество полей для просмотра. Мазок оценивают как отрицательный, применяя различную степень увеличения.
ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
В истории развития Л. м. выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:
1) доказательство А. Келером принципиальной возможности создания люминесцентного микроскопа; 2) создание в 1911 г. люминесцентного микроскопа, который был использован русским ботаником М. С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток; 3) применение сильно разбавленных р-ров флюорохромов, избирательно связывающихся с определенными структурами клеток [Хайтингер (М. Haitinger, 1933— 1935)], и прежде всего акридинового оранжевого [Хайтингер, Штруггер (S. Strugger), 1940]; 4) разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки (E. М. Брумберг и Г. Н. Крылова, 1953) и выпуск отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе (МЛ-1, МЛ-2, ОИ-17); 5) создание метода иммунофлюоресценции (см.), нашедшего широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико-биол. исследований [Кунс (А. Н. Goons), 1942, 1950].
В СССР значительный вклад в развитие и распространение Люминесцентной микроскопии в медико-биологических исследованиях сделан М. Н. Мейселем.
Для проведения Л. м. применяют либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биол, микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов (см. Микроскоп). Устройство люминесцентных микроскопов основано на некоторых физ. законах люминесценции. Один из них — закон Стокса, согласно к-рому максимум спектра люминесценции смещен в длинноволновую область по отношению к спектру возбуждающего света. Это позволяет использовать для Л. м. принцип скрещенных светофильтров, который заключается в том, что коротковолновое световое излучение (ультрафиолетовое, сине-фиолетовое), возбуждающее люминесценцию, выделяется возбуждающим светофильтром, помещенным перед осветителем микроскопа. После прохождения препарата, в к-ром возбуждается люминесценция, этот свет полностью поглощается запирающим светофильтром, пропускающим более длинноволновый свет люминесценции.
Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения к-рого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой (или набором таких пластинок), применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак-иллюминатор, используемая в отечественных люминесцентных микроскопах (а в последнее время и в люминесцентных микроскопах, выпускаемых зарубежными фирмами), имеет ряд существенных преимуществ: 1) интерференционная светоделительная пластинка с нанесенными на нее слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции; 2) объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещенность препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвертой степени апертуры объектива; 3) люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа. Источниками освещения для Л. м. чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также ксеноновые лампы и кварцево-галогенные лампы накаливания. В качестве светофильтра применяют окрашенное в массе оптическое стекло или используют интерференционные светофильтры, имеющие лучшие спектральные характеристики.
Для возбуждения люминесценции при Л. м. пользуются также оптическими квантовыми генераторами— лазерами, излучение которых обладает высокой интенсивностью и монохроматичностью. При этом отпадает необходимость в применении возбуждающих светофильтров.
Поскольку для возбуждения люминесценции при Л. м. обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зеленую область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычную стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стекла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям.
В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный р-р глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт и др.).
М. Я. Корном и М. М. Бутсловым с сотр. (1968) разработана аппаратура и методика цветной люминесцентной микрофото- и киносъемки с использованием электронно-оптических усилителей яркости, позволяющих на несколько порядков уменьшить экспозицию и проводить регистрацию динамики процессов, происходящих в живых клетках.
Для количественной регистрации интенсивности люминесценции структур микрообъектов — цитофлюориметрии — применяют преимущественно фотоэлектрические методы с использованием фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в качестве чувствительного регистрирующего прибора (см. Фотоумножители). Используют также метод регистрации интенсивности люминесценции клеток и их структур в определенных участках спектра — цитоспектрофлюориметрию. Преимущества цитофлюориметрии перед абсорбционной цитофотометрией — ее более высокая чувствительность, отсутствие влияния характера распределения вещества в клетке пли структуре клетки на результаты измерений.
Одним из вариантов количественной регистрации люминесценции микрообъектов является метод импульсной цитофлюориметрии (цитофлюориметрии в потоке) и «сортировки» клеток по люминесцентным характеристикам. Эти методы позволяют проанализировать интенсивность люминесценции десятков тысяч клеток в минуту и провести их разделение по характеру люминесценции. Среди методов люминесцентного изучения микрообъектов наибольшее распространение получили прямое флюорохромирование — окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция.
Отечественная промышленность выпускает различную аппаратуру для Л. м. Наиболее широко используется микроскоп МЛ-2, выпускаемый в нескольких вариантах. Производится также серия унифицированных люминесцентных микроскопов «Люмам», а также люминесцентные осветители с кварцевыми галогенными лампами (ОИ-28, ОИ-30).
Микроскопы серии «Люмам» состоят из унифицированных узлов, различные комбинации которых позволяют получить три рабочие модели (Р1 — РЗ) и три исследовательские (И1 — И3), отличающиеся друг от друга комплектацией и возможностями использования (рис. ).
Осветители ОИ-28 и ОИ-30 устанавливают на обычные биологические микроскопы; они предназначены для освещения объектов сверху через опак-иллюминатор светом, возбуждающим видимую люминесценцию.
Осветитель ОИ-30 отличается тем, что в его комплект входят контактные объективы.
Люминесцентную микроскопию широко применяют в вирусологии, микробиологии, гематологии, клин, цитодиагностике (особенно в онкологии для обнаружения малигнизированных клеток), в цитогенетике для изучения хромосом. С этой целью на протяжении длительного времени используют флюорохром акридиновый оранжевый; применяют также флюорохромы бромистый этидий (этидиум бромид) и йодистый пропидий (припидиум йодид), преимущественно для цитофлюориметрии ДНК, а также люминесцентные варианты реакции Фейльгена. Акридиновый оранжевый получил распространение в люминесцентной микроскопии нуклеопротеидов благодаря тому, что комплексы, образованные этим флюорохромом с двуспиральной ДНК, обладают зеленой люминесценцией, а комплексы с РНК и односпиральной ДНК — красной люминесценцией. Известны также люминесцентно-цитохим. методы выявления белков и липидов. Для качественного и количественного изучения локализации белков в клетках используют проционовые красители, флюорескамин, а липидов — 3,4-бензпирен, фосфин ЗР и др. Тетрациклин и его производные применяют для люминесцентно-микроскопического изучения костной ткани и некоторых изменений в клетках при малигнизации.
Л. м. в сочетании с прямым флюорохромированием фиксированных препаратов используют при бактериоскопической диагностике для обнаружения кислотоустойчивых микобактерий, гонококков, возбудителей дифтерии, возбудителей малярии в мазках крови и др. Преимущества этого метода заключаются в его более высокой чувствительности по сравнению с обычными методами окраски (напр., окраски по Цилю—Нельсену). Флюорохромирование применяют также в санитарно-бактериол. исследованиях для обнаружения и подсчета микроорганизмов в воде и почве. Одним из методов люминесцентномикроскопической диагностики является обнаружение микроколоний на мембранных фильтрах после кратковременного подращивания и флюорохромирования.
Еще в 1940 г. Штруггер предложил использовать акридиновый оранжевый для дифференциации живых и мертвых бактерий, однако последующие исследования показали недостаточную надежность этого метода. В связи с этим для определения жизнеспособности клеток (в частности, при воздействии на них цитотоксических факторов) используют диацетат флюоресцеина или его сочетание с бромистым этидием. Нелюминесцирующий эфир флюоресцеина расщепляется эстеразами жизнеспособной клетки с освобождением ярко люминесцирующего зеленым флюоресцеина, а бромистый этидий обусловливает красную люминесценцию только мертвых клеток.
Для изучения физ.-хим. состояния мембран клеток используют так наз. гидрофобные флюоресцентные пробы. С этой целью клетки обрабатывают веществами, которые не люминесцируют в р-ре, но начинают люминесцировать, связываясь с гидрофобными участками мембран клетки, причем интенсивность и цвет люминесценции зависят от хим. строения и физ.-хим. состояния структур, с к-рыми связаны эти флюорохромы. Одним из наиболее распространенных веществ такого рода является 1-анилино-S-нафталин-сульфоновая к-та (1,8 АНС).
Методом изучения физ.-хим. состояния макромолекул, с к-рыми связаны флюорохромы в различных клеточных структурах, является также поляризационная люминесцентная микроскопия.
Существенное преимущество Люминесцентной микроскопии перед другими методами микроскопического исследования — возможность прижизненного (цветн. рис. 1—3) и суправитального флюорохромирования с использованием очень низких малотоксичных концентраций флюорохромов. При этом различные флюорохромы могут связываться с разными структурами клеток. Акридиновый оранжевый, напр., накапливается в лизосомах живой клетки, и они начинают люминесцировать красным светом. Такую же люминесценцию приобретают фагоцитированные бактерии внутри фагосом. Тетрациклин связывается с митохондриями клеток или их аналогами у бактерий и люминесцирует желто-зеленым светом, причем интенсивность люминесценции (количество связавшегося тетрациклина) зависит от чувствительности бактерий к этому антибиотику.
Возможно также флюорохромирование клеток и тканей in situ для изучения их с помощью контактной Л. м.
Люминесцентная микроскопия вирусов применяется при лаб. диагностике вирусных заболеваний для выявления вирусного антигена в клетках, изучения хим. состава внутриклеточных вирусных включений, определения относительной концентрации вирусных антигенов и нуклеиновых к-т по интенсивности специфической флюоресценции и т. д. В зависимости от целей исследования в качестве объектов используют мазки, отпечатки, соскобы тканей или препараты клеточных культур.
В современной вирусологии наиболее распространены два метода Л. м.: 1) идентификация и дифференциация нуклеиновых к-т вирусов в инфицированных клетках и очищенных вирусных суспензиях с помощью флюорохромов аминоакридинов; 2) выявление вирусных антигенов с помощью иммунофлюоресценции.
Из аминоакридинов чаще применяют акридиновый оранжевый, придающий молекулам двуспиральных нуклеиновых к-т (как правило, ДНК) зеленую, а односпиральных нуклеиновых к-т (как правило, РНК) рубиново-красную флюоресценцию (цветн. рис. 4—8). Метод применим как на нативных препаратах, так и после фиксации в ацетоне, жидкости Карнуа и др. Результаты окраски в значительной мере зависят от концентрации (обычно 1 : 10 000 — 1 : 100 000) и pH флюорохрома.
Метод иммунофлюоресценции используют для идентификации вирусов в клетках, изучения динамики накопления вирусного антигена в клетке, определения внутриклеточной локализации скоплений вируса, выяснения природы вирусных включений, изучения антигенной структуры вирусов, дифференциации близкородственных вирусов, титрования вирусов в клеточных культурах, выявления антигенов опухолеродных вирусов в тканях и клетках, изучения патогенеза вирусных заболеваний, контроля вирусной контаминации клеточных культур, исследования хрон, вирусных инфекций и т. д. Метод применим как в прямой, так и в непрямой модификациях. Для правильной интерпретации результатов исследования важно учитывать концентрацию и чистоту применяемых антител и их конъюгатов с флюорохромами, сроки и температуру фиксации препаратов (обычно ацетоном) и обработки их антителами. Наиболее часто для метки антител используют изотиоцианат флюоресцеина (ФИТЦ), дающий характерное зеленое свечение (цветн. рис. 9), и сульфохлорид лиссамин-родамина В 200, светящийся оранжево-красным светом.
Метод иммунофлюоресценции допускает также выявление в клетках и тканях антител к вирусным антигенам.
Л. м. вирусов применяют для диагностики таких инфекций, как оспа, герпес, эпидемический паротит и др. Особое значение имеет Л. м. в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, когда отпечатки со слизистой оболочки носа больных (риноцитограммы) обрабатывают с помощью названных выше методов с целью выявления антигенов или определения типа нуклеиновых к-т. Т. о. проводят дифференциальную диагностику между инфекциями, вызванными вирусами гриппа А2 или В, парагриппа, аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом или сочетаниями названных вирусов. Возможна также диагностика путем Л. м. клеточных культур, инфицированных материалом больных. Окончательный диагноз во всех случаях ставят по сочетанию данных Л. м. с результатами вирусологических и серологических исследований больных.
Люминесцентная микроскопия органов и тканей — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патол, гистологии. Основными преимуществами Л. м. являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим, методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию. Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение, возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин B2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин B1 в щелочном р-ре переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной к-ты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид— голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохим, количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.
Вторичная люминесценция органов и тканей достигается с помощью обработки препаратов флюорохромами (см.). Акридиновый оранжевый применяют для диагностики рака в цитол, и гистол, препаратах. Этот же краситель используют для определения ранних сроков инфаркта миокарда (участки ишемии имеют зелено-желтую люминесценцию). Корифосфин и акридиновый оранжевый применяют для выявления кислых мукополисахаридов. Такие флюорохромы, как кофеин 5 и родамин, могут быть использованы для определения гликогена. Фосфин 3Р применяют для определения липидов, с этой же целью используют р-р 3,4-бензпирена в насыщенном р-ре кофеина (липиды имеют голубовато-белую люминесценцию). Тиофлавин Т. S. окрашивает амилоид (зеленая люминесценция), поэтому его широко применяют для диагностики амилоидоза внутренних органов. С помощью р-ра морина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция). При обработке препаратов р-ром солохрома черного удается выявить алюминий (желто-оранжевая люминесценция). С помощью родамина 6Ж в легких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).
С помощью метода иммунофлюоресценции можно выявить гормоны, антигены и антитела (цветн. рис. 9), различные продукты обмена, идентифицировать гистогенетически незрелые опухоли, различные инфекционные заболевания и т.д. Развитие иммунохимии еще больше расширило возможности этого метода. Появилась возможность определять с помощью искусственных гаптенов небелковые вещества в тканях и клетках.
М. Я. Корн; В. А. Варшавский (пат. ан.), Я. E. Хесин (вир.).