На чем основана микроскопия
Методы световой микроскопии
Световая, или оптическая, микроскопия — это один из основных методов исследования частиц, неразличимых человеческим глазом. Данный метод имеет широкое распространение в медицине, фармакологии, биологии, металлографии, криминалистике и других сферах.
Увеличение изображения в световом микроскопе обеспечивается системой собирательных линз, расположенных в окуляре и объективе.
Метод световой микроскопии
Предельная разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм. Это понятие отражает минимальное расстояние, на котором 2 соседние точки определяются как отдельные объекты. Микрочастицы, клеточные структуры и дефекты поверхности имеют размер менее 100 мкм, поэтому для их исследования требуется специальное оборудование.
Историческая справка
Первые оптические микроскопы были изобретены в XVI-XVII вв. Первым, кто заметил увеличительный эффект комбинации из нескольких линз, был венецианский врач Джироламо Фракасторо. В 1609 г. Галилео Галилей представил собственный вариант прибора с 2 стеклами: выпуклым и вогнутым. Первое устройство называлось оккиолино (occhiolino).
Практическое применение микроскопа началось с конца XVII в., когда Антони Ван Левенгук использовал собственное оптическое устройство для исследования биологических структур. Его микроскоп содержал всего одно мощное стекло, что уменьшало количество дефектов картинки.
Приборы Левенгука позволяли увеличить изображение в 275 раз и рассмотреть строение бактерий, дрожжей, эритроцитов, одноклеточных микроорганизмов и насекомых.
Популяризации микроскопии способствовала и книга английского исследователя Роберта Гука, которая вышла в 1664 г. В ней ученый ввел термин «клетка» и опубликовал гравюры некоторых микрообъектов.
В течение следующих столетий конструкция оптического микроскопа непрерывно совершенствовалась. Несмотря на то, что в первой половине XX в. были изобретены электронные приборы, которые позволяли рассмотреть нанообъекты, световой метод не теряет своей популярности. В 2006 г. группа немецких ученых разработала оптическое устройство под названием наноскоп, которое обладает разрешающей способностью 10 нм.
Подробно о принципе действия
Принцип работы оптического микроскопа основывается на прохождении прямого или отраженного луча света через систему линз.
Объектив прибора содержит до 14 стекол. При прохождении светового пучка через эту часть устройства изображение увеличивается до 100 раз, а при прохождении окуляра — в 20-24 раза. Выпуклые и вогнутые стекла позволяют сфокусировать картинку на сетчатке или приспособлениях для документирования информации.
Видимое излучение, которое создает осветительная система прибора, ограничивают несколькими диафрагмами. Это повышает четкость изображения.
Увеличивающие линзы имеют 2 дефекта. Сферическая аберрация мешает фокусировать сразу все поле исследования, а хроническая приводит к появлению яркой каймы по контуру изображения. Чтобы компенсировать дефекты, окуляр и объектив оснащаются корригирующими стеклами.
Где применяется
Методы световой микроскопии применяют в следующих областях науки и промышленности:
В целом об устройстве светового микроскопа
Оптический микроскоп состоит из следующих элементов:
Некоторые модели прибора оборудованы дополнительными объективами, системами записи и передачи информации.
Виды световых микроскопов с описанием
Особенности конструкции зависят от предназначения микроскопа. Для увеличения четкости изображения используют методы флуоресценции, люминесценции, инверсии и др.
Биологическое оборудование
Биологические приборы позволяют исследовать прозрачные или полупрозрачные объекты. Принцип их работы основан на изучении светлого поля в потоке проходящего света. Такие микроскопы применяют в лабораторной диагностике, ботанике, цитологии, микроэлектронике, археологии и пищевой промышленности.
Для повышения разрешающей способности используют иммерсионные оптические системы. В этом случае между образцом и первым стеклом вводится жидкость с высоким коэффициентом преломления (минеральное масло, раствор глицерина, дистиллированная вода и др.).
Криминалистическое оборудование
Главная особенность криминалистического микроскопа — это возможность сравнения 2 объектов. Такое исследование помогает найти сходство между компонентами взрывных устройств, гильзами, пулями, волосами, волокнами и другими уликами.
Приборы для криминалистики оснащают фото- и видеокамерами, а также программным обеспечением.
Это позволяет снизить вероятность ошибок, построить модели объектов и сравнить с данными из электронных источников.
Флуоресцентные микроскопы
Флуоресцентные, или люминесцентные, микроскопы позволяют исследовать объекты, которые испускают световой поток после облучения ультрафиолетом. Они оборудованы коротковолновым источником освещения, светофильтрами и интерференционной пластинкой.
Флуоресцентные микроскопы активно применяют в лабораторной диагностике, в частности, при изучении клеток крови и антигенов. Для анализа предметов, которые не излучают свет, используют люминесцентные красители и порошки.
Поляризационные микроскопы
Поляризационный прибор является наиболее сложным из всех представленных видов микроскопов. Его используют для исследования анизотропных материалов, полимеров, некоторых клеток и микробиологических объектов.
Источник света со специальными фильтрами формирует поляризованный поток, который облучает образец.
Оптическая система интерпретирует двойное лучепреломление среды и позволяет изучить ее структуру.
Инвертированные с перевернутым положением объектива
В инвертированном микроскопе объектив располагается не над образцом, а под предметным столиком. Такие приборы применяют в биологии, медицине, промышленности, металлографии, криминалистике и других сферах.
Перевернутое положение оптической системы позволяет изучать более крупные образцы и работать со специальной посудой.
Микроскопы для металлографии
Металлографические микроскопы предназначены для исследования поверхности непрозрачных объектов. Изображение получают путем преломления отраженного светового луча.
Предметом изучения являются микродефекты поверхности и зерна сплавов. Помимо металлургии и промышленности, такие устройства применяют в геологии и археологии. Для обеспечения четкости используют специальные системы линз и зеркал.
Стереомикроскопы (дают объемное изображение)
Стереомикроскопы оснащены 2 объективами, что позволяет получать объемное изображение исследуемого образца. По сравнению с устройствами плоского поля они дают более резкую, четкую и контрастную картинку.
Такие приборы используют в точном машиностроении, ювелирном деле и других областях промышленности.
Моновидеомикроскопы с возможностью получения видео
Видеомикроскопы предназначены для динамического наблюдения за образцом и фиксации изображения. Для повышения эффективности работы их оснащают специальными линзами, светофильтрами и адаптерами.
Разновидности методов световой микроскопии
Выбор метода оптической микроскопии определяется особенностями объектов и целью исследования.
Светлое поле в потоке проходящего света
Данный метод основан на принципе прохождения потока света через образец. Предмет частично поглощает и рассеивает попадающие на него лучи, что позволяет сформировать изображение.
Светлопольную микроскопию применяют для изучения окрашенных тканей животных и растений, тонких шлифов и др. Для прохождения светового пучка препарат должен быть прозрачным.
Косое освещение
Данный метод является разновидностью микроскопии светлого поля. Чтобы выявить рельеф и сделать изображение более контрастным, поток направляют под большим углом к образцу.
Светлое поле в отраженном свете
Светопольная микроскопия в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов (сплавов, покрытий, руд и др.). Свет падает на образец сверху, а основная оптическая система исполняет роль объектива и конденсора.
Изображение формируется за счет того, что элементы поверхности по-разному отражают и рассеивают попадающие лучи. Травление дает возможность изучить не только дефекты, но и микроструктуру и фазовый состав образца.
Темное поле
Метод темного поля предназначен для изучения прозрачных образцов, которые не абсорбируют свет. Специальный конденсор направляет лучи так, что они формируют полый конус, в центре которого находится объектив. Таким образом, большая часть лучей не попадает в оптическую систему.
Изображение представляет собой темное поле с небольшими светлыми включениями, которые формируются за счет рассеяния света частицами препарата.
Ультрамикроскопия
Метод ультрамикроскопии является разновидностью темнопольного. Для исследования образцов используют сильные источники света, а лучи направляют перпендикулярно предметному столу. Эффект рассеяния волн позволяет обнаружить частицы менее 10 нм.
Фазовое контрастирование
Метод фазового контраста позволяет изучать прозрачные и неокрашенные образцы. При малом различии в коэффициенте преломления изображение нельзя получить ни на светлопольном, ни на темнопольном микроскопе, поскольку разница в поглощении и рассеянии света будет минимальной.
Однако при прохождении через образец волна приобретает фазовый рельеф, который фиксируется специальным объективом. В изображении он отображается как различие в яркости элементов.
Аноптральный контраст
Данная методика является подвидом фазовой микроскопии. На иммерсионную линзу наносят кольцо из сажи, которое пропускает 10% лучей и совпадает с контуром кольцевой диафрагмы конденсора. При отсутствии образца амплитуда световых волн уменьшается на 90%.
Проходя через среды разной плотности, лучи дифрагируют, в результате чего их амплитуда остается неизменной.
За счет этого поле исследования получается темным, а частицы образца — светлыми.
Поляризационный метод
Анализ анизотропных материалов проводят в свете, пропущенном через специальную фильтрующую пластинку. При прохождении через образец плоскость поляризации лучей меняется.
По разнице между начальными и конечными характеристиками волн определяют количество оптических осей, их ориентацию и др.
Интерференционная микроскопия
Интерференционный метод основан на параллельном прохождении 2 лучей через предметный столик и мимо него. В окуляре микроскопа когерентные волны соединяются и интерферируют между собой.
При прохождении через образец первый луч запаздывает по фазе, что влияет на результирующую амплитуду и яркость изображения.
Люминесценция или флуоресценция
Принцип люминесцентной микроскопии основан на том, что некоторые образцы испускают видимый свет после облучения ультрафиолетом. Перед исследованием препараты обрабатывают флуоресцирующими антисыворотками, порошками или маркерами.
Волны ультрафиолетового спектра применяют для повышения разрешающей способности микроскопа. Для изучения препаратов, которые не испускают видимый свет после воздействия УФ-лучей, используют фотокамеры и кварцевые линзы.
На чем основана микроскопия
Микроскопия – это изучение объектов и элементов чрезвычайно малых размеров. Человеческий глаз имеет предел разрешения и детализации таких объектов, диктуемый его природными свойствами. Для преодоления этого биологического ограничения используются различные приборы-микроскопы. На сегодняшний день, одним из ведущих методов исследования микрообъектов в биологических науках является оптическая (она же световая) микроскопия. Световые микроскопы являются важнейшими инструментами как при проведение некоторых рутинных медицинских анализов, так и в биологических и медико-биологических научных исследованиях. Они незаменимы при изучении морфологических свойств микробиологических объектов, к которым относятся насекомые и их части, многие паразиты, клетки растений и животных, простейшие и бактерии. Возможность изучения топографии, морфологии, ультраструктуры позволило человеку значительно расширить свои знания о микроорганизмах. В медицине, микроскопы позволяют проводить подсчёт клеток крови, анализ биопсий на структуру, морфологию и наличие определённых включений. С применением молекулярно-биологических техник, появилась возможность выявить локализацию отдельных химических веществ.
Сущность оптических методов
Современная световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч раз, что является достаточным для изучения различных форм жизни на клеточном уровне и других биологических объектов [1, 2]. Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – минимальное расстояние, на котором находятся две точки, различаемые как раздельные объекты. Контраст –возможность различать объекты и отдельные детали от их фона. Если различие в яркости объекта и фона составляет менее 3 – 4 %, то его невозможно различить, даже если оптика микроскопа теоретически способна разрешить его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики прибора уловить возникающие различия в свойствах луча. Главным ограничением для возможностей светового микроскопа является волновая природа света, которое не позволяет увидеть объекты, размеры которых сопоставимы с волновой длиной электромагнитного излучения светового диапазона, т.е. меньше 1 микрометра.
Для различных нужд создаются оптические системы различной конструкции [3, 4]:
Прямой микроскоп является наиболее часто встречаемой конструкцией. Такая схема используется чаще всего при изучение прозрачных и полупрозрачных микрообъектов размеров, сопоставимых с клетками. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в различных областях биологии (ботанике, микробиологии, цитологии) и медицины (обычно это микробиологический и гистологический анализ материала).
Инвертированная схема микроскопа отличается от прямой тем, что в ней объективы находятся не над, а под исследуемым предметом. Это позволяет оптимизировать конструкцию инструмента для работы с достаточно большими по своему объему объектами, вроде флаконов для культивирования клеток. В зависимости от назначения и особенностей конструкции, инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и др. Подобные приборы широко используются при различных научных и лабораторных исследованиях в микробиологии и медицине.
Стереоскопические или стереомикроскопы имеют в своей конструкции два расположенных под углом объектива, и благодаря этому позволяют получать стереоскопическое изображение исследуемого объекта. Стереомикроскопы обладают существенно большей глубиной резкости, чем обычные, что позволяет использовать их для изучения относительно крупных и выпуклых микрообъектов – таких как части растений, грибов, колонии микроорганизмов. Выделяют два типа конструкции световых микроскопов: схема Грену и оптическая система с общим главным объективом.
Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле [2,5]. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. У светового микроскопа максимальная разрешающая способность составляет 0,2 мкм, что обеспечивает высокоточное увеличение микроскопа до 1500х.
Фазово-контрастная микроскопия (рис. 1) используется для получения высококонтрастных изображений прозрачных образцов, таких как живые клетки, микроорганизмы, тонкие кусочки ткани, литографические узоры, волокна, латексные дисперсии, осколки стекла и субклеточные частицы, включая ядра и другие органеллы. Метод контраста участка использует оптический механизм для того, чтобы перевести мельчайшие изменения в участке в соответствующие изменения в амплитуде, которые можно визуализировать как разницы в контрасте изображения. Одно из главных преимуществ микроскопии контраста участка в том, что живущие клетки можно рассмотреть в их естественном положении, без предварительного убийства. В результате динамика протекающих биологических процессов может наблюдаться и регистрироваться в высоком контрасте, с высокой четкостью мельчайших деталей образца.
Чтобы хорошо визуализировать эти биологические материалы, они должны иметь контраст, вызванный надлежащими показателями преломления, или окраску. Поскольку красители обычно токсичны, для достижения контраста может использоваться темная поляризационная микроскопия [2, 6]. В темнопольной микроскопии конденсатор предназначен для формирования «полого» конуса света (рис. 2). В темной микроскопии объектив находится в темной полости этого конуса, а свет распространяется вокруг объектива, но не входит в зону конуса. Все поле зрения кажется темным, но когда на предметный столик помещается образец, он кажется ярким на темном фоне. Он похож на заднее освещение объекта, который может быть того же цвета, что и фон, на котором он сидит, – чтобы он выделялся. Темнопольная микрокопия позволяет увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.
Рис. 1. Интернет: Stormoff, stormoff.ru, 2018
Рис. 2. Интернет: Studopedia, studopedia.ru, 2018
Лазерная конфокальная микроскопия
Конфокальная микроскопия (рис. 3) обладает такими особенностями, как контролируемая глубина резкости, устранение шумов вне фокуса и возможность сбора последовательных оптических секций из толстых образцов [5]. Конфокальная микроскопия основана на использовании пространственной фильтрации для устранения света вне фокуса и вспышки в образцах, которые толще плоскости фокусировки. Когда флуоресцентные образцы визуализируются с использованием обычного широкополосного оптического микроскопа, вторичная флуоресценция, испускаемая образцом вдали от интересующей области, часто мешает разрешению тех объектов, которые находятся в фокусе. Конфокальный метод визуализации обеспечивает незначительное улучшение как в осевом, так и в поперечном разрешении, но также обладает способностью исключить из изображения вспышку «вторичную флуоресценцию», которая возникает в густых флуоресцентно меченых образцах. Эта особенность вызвала большой рост популярности конфокальных микроскопов. Освещение достигается путем сканирования одного или нескольких фокусированных лучей света, обычно от лазера. Изображения, полученные путем сканирования образца таким образом, называются оптическими сечениями.
Рис. 3. Интернет: 5fan, 5fan.ru, 2018
Мультифотонная микроскопия схожа с конфокальной и обеспечивает четкие преимущества для трехмерной визуализации [6]. Она хорошо подходит для визуализации живых клеток, особенно в интактных тканях, таких как срезы мозга, эмбрионы, а так же целые органы или небольшие организмы. Эффективная чувствительность флуоресцентной микроскопии, особенно при работе с толстыми образцами, как правило, ограничена вспышкой без фокуса. Это ограничение значительно сокращается в конфокальном микроскопе, с помощью конфокального отверстия для отклонения фоновой флуоресценции фокуса и получения несжатых оптических секций менее 1 микрометра. Мультифотонная микроскопия имеет преимущества: 1. Вследствие значительно меньшего поглощения тканей и клеток в ИК – области по сравнению с УФ, уменьшается повреждение живых клеток фотоиндуцированными процессами. 2. Достигается большая глубина проникновения излучения в биологические объекты. 3. Отсутствует возбуждение и выцветание флуорохромов вне фокального микрообъема, поэтому конфокальная диафрагма не требуется.
Эпоха, когда оптическая микроскопия была чисто описательным инструментом прошла. В настоящее время формирование оптического изображения является лишь первым шагом к анализу данных. Микроскоп выполняет этот первый шаг в сочетании с электронными детекторами, процессорами изображений и устройствами отображения, которые можно рассматривать как расширения системы формирования изображения. Компьютеризированное управление фокусом, сценическим положением, оптическими компонентами, ставнями, фильтрами и детекторами широко распространено и позволяет проводить экспериментальные манипуляции, которые невозможны для человека при использовании механических микроскопов. Возрастающее применение электрооптики в флуоресцентной микроскопии привело к созданию оптических пинцетов, способных манипулировать субклеточными структурами или частицами, изображениями отдельных молекул и широким спектром сложных спектроскопических приложений.
Микроскопия
Клетки крови: эритроцит и лейкоцит
Микроскопия (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и др.-греч. μΙκροσ σκοποσ — вижу) — способ изучения малых объектов с помощью микроскопа. Микроскопия позволяет получить изображения тонкой структуры объектов (качество зависит от разрешающей способности микроскопа).
Содержание
История
Первый микроскоп был создан лишь в 1595 году Захариусом Йансеном. [1] Современные микроскопы отличаются высокой степенью специализации. Существуют металлографические, биологические, полярографические, а также универсальные микроскопы, общего назначения.
Виды микроскопии
Существует несколько видов микроскопии: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская микроскопия (рентгеновская лазерная микроскопия), отличающиеся конструктивными элементами, деталями, узлами самих микроскопов, что обеспечивает наблюдение в разных диапазонах спектра электромагнитных лучей.
Микроскопия в зависимости от микроскопов разделяется как:
Виды микроскопов
Для исследования объектов разного типа, и в зависимости от требуемой величины оптического разрешения и других требований, созданы разные микроскопы:
Разрешающая способность
Оптическая микроскопия
Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены оптичские микроскопы различных типов.
Немецкие ученые Штефан Хелль в 2006 году Stefan Hell и Мариано Босси Mariano Bossi из Института биофизической химии разработали микроскоп под названием Флюоресцентный наноскоп с разрешением в 1-10 нм и получать высококачественные трехмерные 3D изображения. Вся суть заклюсается в том, что здесь впервые применён принцип комбинированой микроскопии, когда опорное освещение по принципу лазерной рентгеноскопии позволяет получить оптическое изображение с выходными длинами волн оптического микроскопа, но обеспечивать разрешение микроскопии в диапазоне 1-10 нм.
Электронная микроскопия
С изобретением электронного микроскопа — 1930-е годы — начало создания современной науки об исследовании и изучении микромира под названием микрография или микроскопия.
Рентгеновская микроскопия
История рентгеновской микроскопии
До создания рентгеновских микроскопов работали с оптическими приборами, использующих лучи видимого света, так как и глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Соответственно, оптические микроскопы не могли иметь разрешения менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,4—0,7 мкм, или 400—700 нм) c возможным максимальным увеличением в 2000 раз. [3]
Идея просвечивающего электронного микроскопа состояла в замене опорного электромагнитного излучения на электронный пучок. Известно, что для увеличения разрешения микроскопов, использующих Электромагнитное излучение, необходимо уменьшение длины волны электромагнитного излучения до ультрафиолетового диапазон вплоть до рентгеновского (длина волны сопоставима с межатомными расстояниями в веществе) и основная трудность состоит в фокусировке ультрафиолетовых и, тем более, рентгеновских лучей. Последние вообще не поддаются фокусировке.
Возможности рентгеновской микроскопии
Голова мухи (фото сделано с помощью электронного микроскопа )
Проекционные рентгеновские микроскопы
Схема Рентгеновского микроскопа проекционного
Проекционные рентгеновские микроскопы представляют собой камеру, в противоположных концах которой располагаются источник излучения и регистрирующее устройство. Для получения чёткого изображения необходимо, чтобы угловая апертура источника была как можно меньше.
Увеличение (М) в методе рентгеновской проекционной микроскопии определяется отношением расстояний от источника рентгеновского излучения до детектора (b) к расстоянию от источника до объекта (а):
В микроскопах такого типа до недавнего времени не использовались дополнительные оптические приборы. Основным способом получить максимальное увеличение является размещение объекта на минимально возможном расстоянии от источника рентгеновского излучения. Для этого фокус трубки располагается непосредственно на окне рентгеновской трубки либо на вершине иглы анода, помещенной вблизи окна трубки. В последнее время ведутся разработки микроскопов, использующих зонные пластинки Френеля для фокусировки изображения. Такие микроскопы имеют разрешающую способность до 30 нанометров.
Новое направление в рентгеноскопии
Рентгеновская оптика преломления
Планарные параболические линзы
Как известно, показатель преломления Х-лучей мало отличается от единицы. Рентгеновская оптика являлась предметом постоянных оценок и рассуждений. Получение и появление составных рентгеновских линз и призм — начало новых шагов во всём мире в деле создания новых оптических устойств микроскопов, телескопов с использованием диапазона спектра длин волн жёстких Х-лучей, способных их преломлять и фокусировать с разрешением 5-10нм [5]
Получение изображений в реальном и фурье-пространствах
Рис.1,Применение планарных линз на примере прохождения Х-лучей в кристаллах
Рис.2,Cхема флюоресцентного наноскопа с использованием Х-линзы, преломляющей Х-лучи
Для получения рентгеновских изображений в действительном пространстве сейчас в основном применяют преломляющие линзы, рассмотренные выше (Рис.1,2), с параболическим аксиально симметричным профилем. [7] Имеются и другие Х-линзы с другими рассчётными профилями. В настоящее время опережающее развитие получает безлинзовая компьютерная микроскопия в томографии, где происходит форимрование трёхмерных изображенй структуры объектов (3D). Сейчас созданы нанотомографы с разрешением 200нм. [8] Для повышения разрешения трехмерных изображений величиной в 25-50нм предполагается применение в топографии методов преобразований сигналов изображений нанообъектов — спектров дифракции в фурье-пространстве (с последующими преобразованиями сигналов — дискретизациия, калибровка, восстановление их при АЦП и т.д. с выдачей в стерео пространстве изображений на экране монитора). Флюоресцентная рентгеноскопия с разрешением 5-10нм отличается тем, что в разных участках объекта периодически создаются видимые раздельно флуоресцирующие молекулы и наночастицы. Лазер (рентгеновский) обеспечивает такое их возбуждение, которое достаточно не только для регистрации их неперекрывающихся изображений, но и для обесцвечивания уже зарегистрированных флуоресцирующих молекул. При этом десятки тысяч кадров с зарегистрированными изображениями одиночных молекул и наночастиц (в виде пятен диаметром порядка длины волны света флуоресцении, умноженной на увеличение микроскопа), обрабатываются на компьютере для поиска координат центров пятен и создания изображения объекта по миллионам вычисленных координат центров пятен, соответствующих координатам индивидуальных флуоресцирующих молекул и наночастиц. При этом применяемые две цифровые, размещённые под углом, с высоким разрешением камеры, улавливая светящиеся окрашенные в RGB цвета микрочастицы (молекулы, атомы) при формировании стереоизображений окрашивают их в нужный цвет. [9]