На что распадаются липиды

Из липидов — в дирижеры клеточных реакций, или Как общаются клетки

Снимок конфокальной микроскопии эмбриональных фибробластов мыши, обработанных индуктором ферроптоза RSL3 (100 nM, 6h)

Авторы

Редакторы

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Задумывались ли вы когда-нибудь о том, что клетки общаются между собой? Ведь клеточный мир настолько многообразен и велик, что в нем без языка не обойтись! Всем известные гормоны — только один из диалектов такого «языка»! В этой статье мы расскажем о том, как липиды помогают клеткам «общаться». Почему такой, казалось бы, простой химический процесс, как окисление липидов, может приводить к гибели клетки? Как клетки понимают, когда пора заканчивать фазу воспаления и переходить к восстановлению? Что такое ферроптоз. Вы все еще читаете аннотацию? Давайте скорее окунемся в удивительный мир редокс-липидомики и взглянем на липиды по-новому!

Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Давно известно, что без липидов человеческий организм не может существовать. Эта обширная группа природных органических соединений, включающая жиры и жироподобные вещества, необходима для построения клеточных мембран и регуляции обмена веществ. Изучением липидов занимается липидомика, а появление раздела «редокс-липидомика» (окислительно-восстановительная липидомика, часть липидомики, занимающаяся характеристикой окисленных липидов) позволило по-новому взглянуть на роль продуктов окисления липидов и оценить их влияние на ключевые процессы, происходящие в клетках.

О липидах в составе клеточных мембран читайте в статье «Липидный фундамент жизни» [1]. — Ред.

В дополнение к природному липидому (совокупности всех липидов организма), существуют виды липидов, полученные в результате ферментативных и неферментативных модификаций (эпилипидом), что делает общую картину еще более сложной, поскольку их функции все еще в значительной степени неизвестны. Окисленные липиды представляют собой фракцию эпилипидома, которая привлекла большое внимание ученых из-за их роли в возникновении и развитии многих заболеваний человека. Однако основной проблемой редокс-липидомики остается отсутствие оптимальных вычислительных инструментов для надежной, точной и специфической идентификации уже открытых и еще неизвестных модифицированных липидов. В настоящее время жидкостная хроматография и масс-спектрометрия являются основными методами, позволяющими определить количество липидов в клетке, оценить их участие в ряде физиологических механизмов и даже изучить структуру продуктов окисления этих веществ [2].

Знакомство с липидами

Молекулы липидов чрезвычайно разнообразны, их насчитывают более миллиона вариантов [3]! Впечатляющее количество, по сравнению с 70 000 выявленных белков и 30 000 генов! Для удобства химики разделили все липиды на две большие группы:

К первой группе относятся простые липиды, состоящие исключительно из спирта и жирных кислот (воски, триацилглицеролы, эфиры холестерола), и сложные липиды, в состав которых входят и другие компоненты (фосфолипиды, гликолипиды, сфинголипиды). К неомыляемым липидам относится большая группа стероидов, включающая холестерин и его производные: стероидные гормоны, витамины, желчные кислоты.

Большая роль маленьких молекул

Липиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК — кислоты, содержащие две и более двойных связей), являются важными сигнальными молекулами, регулирующими многие метаболические процессы и клеточные реакции, включая воспаление. Для выполнения этих функций они подвергаются реакциям окисления, то есть присоединяют кислородсодержащие группы.

Окисление липидов происходит с помощью двух основных механизмов. Первый способ — неферментативное перекисное окисление. При этом липиды взаимодействуют с активными формами кислорода (АФК), в результате чего происходит накопление гидроперекисей липидов (LOOH) (рис. 1). В норме процессы перекисного окисления необходимы для поддержания структуры клеточных мембран, функционирования ионных каналов, рецепторов и ферментных систем. Их роль велика и в синтезе липидных медиаторов — биорегуляторов (простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и др.). Однако неконтролируемое свободнорадикальное окисление липидов может приводить к изменению проницаемости мембраны, нарушению ее целостности, а это прямая угроза гибели клетки [3]!

Рисунок 1. Зарождение цепной реакции перекисного окисления липидов. Фосфолипиды клеточных мембран, взаимодействуя со свободными радикалами, превращаются в гидроперекиси липидов, что может влиять на функции мембраны клетки.

Второй путь окисления — ферментативные изменения, отличающиеся высокой селективностью и специфичностью. Ферментативное окисление происходит под действием металлопротеинов: липоксигеназы, циклооксигеназы, цитохрома Р450, пероксидазы. Продукты реакций окисления ПНЖК, выступая в качестве сигнальных молекул, координируют метаболизм и другие физиологические процессы, иными словами, управляют судьбой клетки [4]! Такие вещества носят название эйкозаноидов. Они принимают участие во многих важнейших процессах: росте мышечной ткани, реакциях иммунитета на токсины и патогены, выступают в роли нейромедиаторов и даже гормонов!

К сожалению, человеческий организм не научился синтезировать все необходимые ПНЖК. Возникает вопрос: можно ли их получить извне? Разумеется! Пищевыми источниками полиненасыщенных жирных кислот являются растительные масла, рыбий жир и препараты омега-3-жирных кислот. Таким образом, казалось бы невкусный рыбий жир — просто лакомство для наших клеток!

Из липидов — в дирижеры клеточных реакций

Исследования редокс-липидомики, проведенные при помощи масс-спектрометрии в сочетании с обращенно-фазовой хроматографией, выявили удивительный факт: липиды контролируют активность иммунной системы [4]! При попадании в организм чужеродных агентов, желающих нанести вред и повредить ткани, развивается воспаление, цель которого — устранить патоген. Иммунные клетки, встав на защиту организма, в зоне повреждения вырабатывают «провоспалительные» производные ПНЖК (лейкотриены, липоксины, гипоксины и т.д.), которые усиливают воспаление и таким образом избавляют организм от патогена (рис. 2).

Рисунок 2. Провоспалительные производные арахидоновой кислоты: простагландины, тромбоксаны и лейкотриены

рисунок авторов статьи

Рисунок 3. Противовоспалительные медиаторы: резолвины, протектины, марезины

Но воспаление — патологический процесс, и при удалении повреждающего фактора важно вовремя остановиться и прекратить воспалительный ответ. Здесь на помощь приходят противовоспалительные липидные медиаторы — резолвины, протектины, марезины (рис.3). Они останавливают образование «провоспалительных» медиаторов и обеспечивают защиту клеток от повреждающих факторов.

Кроме того, собственные поврежденные клетки, не способные восстановиться, для перехода воспаления в завершающую фазу и сохранения постоянства внутренней среды должны подвергнуться уничтожению, чему также способствуют липидные медиаторы. Как это возможно? Оказалось, что липидные молекулы фосфатидилсерина (фосфолипида клеточной мембраны) выставляются на мембрану поврежденных клеток и «помечают» их. Фосфатидилсерин на поверхности клеток является сигналом для их поглощения макрофагами и клетками микроглии [5]. В исследованиях также была продемонстрирована значимость этого медиатора: наличие даже одной молекулы фосфатидилсерина уже достаточно для активации фагоцитоза!

Две стороны одной медали

Оказалось, что роль липидов велика не только в уничтожении старых или поврежденных клеток, но и их компонентов, или органелл. Например, для удаления митохондрий, безвозвратно утративших свои функции, на поверхности ее внешней мембраны появляется кардиолипин — фосфолипид, который в норме присутствует только на внутренней мембране органелл. Именно он и служит сигналом митофагии, или уничтожения митохондрий [5]. Удаление исключительно ненужных организму структур без повреждения нормальных клеток требует точной передачи сигналов и имеет решающее значение для поддержания постоянства внутренней среды.

Однако данный процесс может стать опасным для организма. Чрезмерная митофагия описана при многих острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы. Так, при болезни Паркинсона она может привести к гибели нейронов [6]. Контроль качества митохондрий с целью избежания излишнего уничтожения имеет центральное значение для функционирования и благополучия нейронов. Это открывает новые возможности для исследований в области лечения нейродегенеративных заболеваний!

Как липиды «помогают» клетке погибнуть?

Что же делать со старыми клетками, честно отслужившими свой срок? Безусловно, оставлять их на своем месте нельзя, иначе новым здоровым клеткам будет некуда деться. Остается один вариант — аккуратно разобрать и удалить из организма те из них, которые не способны более функционировать. Данный процесс носит названия апоптоза. Валериан Каган и его соавторы доказали, что для осуществления этого процесса необходимо окислить ПНЖК кардиолипина [7]. При необратимых изменениях в клетке знакомый нам кардиолипин образует комплекс с белком дыхательной цепи — цитохромом c — и превращает его в фермент пероксидазу. Пероксидаза тотчас окисляет ПНЖК кардиолипина, и он перемещается на внешнюю мембрану митохондрий, увеличивая ее проницаемость (рис.4). Это приводит к высвобождению других проапоптотических факторов клетки, действие которых приводит к клеточной гибели.

Рисунок 4. Окисление кардиолипина как фактор апоптоза. На рисунке представлена клеточная мембрана, состоящая из бислоя липидов, один из которых — кардиолипин (показан желтым цветом). При взаимодействии с белком цитохромом c (cyt c) кардиолипин превращает его в пероксидазу, которая, в свою очередь, окисляет ПНЖК кардиолипина (на рисунке — cardiolipin hydroperoxide, CL-OOH). Гидроперекись кардиолипина выходит на внешнюю мембрану митохондрии, изменяя ее проницаемость, что приводит к апоптозу.

Новый взгляд на клеточную смерть

Одним из важнейших достижений редокс-липидомики является открытие уникального варианта неапоптотической программируемой гибели клетки — ферроптоза [8]. По сравнению с другими формами этот путь клеточной гибели неповторим. В чем же его особенность? Оказалось, что, в отличие от апоптоза, при котором происходит аккуратная разборка клетки, ферроптоз приводит к клеточному коллапсу, в котором железо и АФК принимают активное участие. Давайте разберемся, как это происходит!

Ферроптоз назван так неспроста. Железо (Fe от лат. ferrum) — основной элемент, необходимый для осуществления ключевого звена данного пути гибели клетки: перекисного окисления липидов (рис. 5) [9], [10]. Перекисное окисление может происходить под действием свободного двухвалентного железа (через реакцию Фентона), а также посредством фермента липоксигеназы, содержащей железо.

Рисунок 5. Ионы железа в организме находятся под строгим метаболическим контролем. Нарушение баланса ионов железа в клетке и возникновение окислительного стресса приводит к цепной реакции окисления липидов и формированию избытка гидроперекисей. Накопление гидроперекисей липидов приводит к развитию ферроптоза. Гидроперекиси фосфолипидов (PL-OOH) образуются внутри клетки с участием различных форм низкомолекулярного внутриклеточного железа и железосодержащих ферментов. Активная GPX4 восстанавливает гидроперекиси липидов до спиртов. В случае ингибирования фермента, например, специфическим ингибитором RSL3, PL-OOH накапливаются в клетках, усиливая развитие окислительного стресса.

Конкретные механизмы редокс-модификации липидов, задействованные в выполнении программы ферроптоза, на сегодняшний день остаются тайной. Но, окрасив клетку различными флуоресцентными красителями, можно увидеть, насколько удивительные очертания они приобретают при ферроптозе (рис. 6) [11]!

Рисунок 6. Снимок конфокальной микроскопии эмбриональных фибробластов мыши, обработанных индуктором ферроптоза RSL3 (100 nM, 6h). Control — необработанные клетки. Liperfluo — флуоресцентный зонд, который после взаимодействия с гидроперекисями липидов способен флуоресцировать, если он встроен в плазматическую мембрану клеток. ER-FAP (ER-targeted fluorogen-activating protein) — флуоресцентный белок, чья флуоресценция активируется при связывании метки с эндоплазматическим ретикулумом.

В клетках организма существуют механизмы, препятствующие неконтролируемому перекисному окислению. Одним из ключевых ферментов здесь является глутатионпероксидаза 4 (GPX4), которая восстанавливает гидроперекиси липидов до спиртов за счет окисления глутатиона (GSH). Далее окисленная молекула глутатиона (GS-SG) восстанавливается с помощью фермента глутатион-редуктазы. В случае инактивации клеточного глутатиона и GSH-зависимой антиоксидантной защиты происходит накопление токсичных липидных АФК и запуск ферроптоза [12].

Две крайности одной и той же сущности. Как ферроптоз реализуется в целом организме и можно ли обернуть его в свою пользу?

Проведенные исследования показывают, что ферроптоз осуществляется во многих типах тканей человека. Так, при отравлении парацетамолом в организме накапливается N-ацетил-p-бензохинонимин, при этом наблюдается истощение глутатиона, в результате чего происходит массивная гибель клетки по механизму ферроптоза [13].

Имеющиеся данные указывают на то, что ферроптоз может выступать одним из ключевых механизмов развития некоторых нейродегенеративных заболеваний, а также является одной из возможных причин гибели клеток в условиях глутаматной эксайтотоксичности [14].

Ионы железа могут играть ключевую роль в гибели эпителиальных клеток почечных канальцев в условиях острой почечной недостаточности [13]. Данный механизм обусловлен нарушением гломерулярной фильтрации и накоплением ионов железа как внутриклеточно, так и в полости канальца, что приводит к реализации клеточной смерти.

Ферроптоз, как механизм регулируемой клеточной смерти, имеет и терапевтическую ценность. Существует ряд потенциальных молекул, ингибирующих Xc – — транспортную систему (эрастин, RSL3), которые, воздействуя на культуру опухолевых клеток, вызывают их гибель по механизму ферроптоза [12], [13]. Как доказать, что это происходит благодаря ферроптозу, а не случайному совпадению? При добавлении к клеткам веществ, связывающих железо, оно становится «неподвижным» и не может участвовать в химических процессах. В этом случае процессы ферроптоза значительно замедляются. Однако не все так просто и радужно! Эти молекулы не обладают высокой специфичностью, и при более высоких дозах клеточная гибель может происходить по механизму апоптоза!

Вывод

Благодаря редокс-липидомике стало известно, что кислородсодержащие липиды играют огромную роль в сохранении постоянства внутренней среды, запуская апоптоз, ферроптоз и контролируя воспаление. Однако стоит принять во внимание, что, несмотря на очевидное значение в регуляции множества биологических функций, содержание окисленных липидов в организме крайне мало (0,03–3,0 моль% от всего липидома организма) [4]. Кроме того, трудности анализа окисленных липидов заключаются в их химической нестабильности, термолабильности и неоднородности окисленных продуктов. Не зря их сравнивают с иголкой в стоге сена!

Источник

Липидный фундамент жизни

Возникшая в 1970-е годы концепция жидкостно-мозаичной модели биологической мембраны, где липидам отводится пассивная роль «океана», в котором «айсберги» белковых комплексов разыгрывают предназначенные им биологические роли, немного устарела. Согласно современным представлениям, тщательно подобранный эволюцией липидный состав мембран играет роль не менее важную, а, возможно, даже более фундаментальную.

картинка в мраморе: Singer & Nicholson, 1972 [3]

Авторы

Редакторы

Жизнь в том виде, в каком мы ее знаем, невозможно представить без биомембраны, разделяющей «внутренний мир» клетки и всё остальное пространство. Мембрана обеспечивает взаимодействие клетки с внешней средой, избирательно пропуская многие вещества, а также является средой протекания множества биохимических процессов. И хотя большую часть полезной работы выполняют белки, которыми мембрана буквально «нашпигована», роль липидного матрикса не стоит недооценивать. Липиды — это не просто «океан», в котором плавают белки. Это «умный» океан, чьи физико-химические свойства были тщательно подобраны в ходе эволюции так, чтобы создать эффективную платформу для функционирования и взаимодействия мембранных белков.

Вопрос зарождения жизни на Земле вряд ли когда-нибудь получит окончательный ответ, но мало кто сомневается в том, что само ее появление стало возможным лишь в тот момент, когда в «первичном бульоне» (так в биологии принято называть растворенные в доисторическом мировом океане простые органические вещества) стали появляться маленькие изолированные области пространства, ставшие основной ареной для эволюции. В этих «первичных клетках» биохимические процессы могли протекать существенно быстрее, нежели на безбрежных просторах океана, и такое разделение является одной из предпосылок для первых, добиологических, шагов эволюции. Один из теоретиков абиотического происхождения жизни на Земле — академик А.И. Опарин — представлял себе эти «первичные клетки» в виде коацерватов (свободно плавающих липидных пузырьков, внутри которых протекала химическая эволюция). Согласно некоторым современным воззрениям, жизнь могла зародиться в гидротермальных источниках, где «первичная клетка» была образована минеральными отложениями [1]. Так или иначе, именно компартментализация (этим сложным словом обозначают обособленность содержимого клетки от внешней среды, а также подразделение самих клеток на внутренние «отсеки») является одним из непреложных признаков жизни.

Краткая история исследования липидов и биомембран

Структурообразующую функцию биологических мембран выполняют липиды — амфифильные молекулы, имеющие полярную головку и неполярный (гидрофобный) хвост. Они малорастворимы в воде и склонны к образованию моно- и бимолекулярных слоев благодаря своей амфифильной природе. Еще из школьного курса биологии известно, что мембрана состоит из двойного слоя (бислоя) липидов, «прячущих» от воды внутрь гидрофобные и выставляющих на поверхность полярные (гидрофильные) части [2].

где M_r — масcа 1 моля триолеина, N_A — число Аводгадро, S_пятна — площадь пятна, V_ложки — объем ложки, ρ_масла — плотность масла. В результате мы получим значение площади S_мол ≈ 1 нм 2 (на молекулу). Несложно оценить и толщину мономолекулярного слоя, равную размеру одной молекулы триолеина, разделив V_ложки на S_пятна — 2,5 нм.

Более ста лет спустя, Чарльз Овертон заметил, что через биомембраны сравнительно легко проникают вещества, хорошо растворимые в липидах, из чего он сделал заключение, что мембрана должна быть образована тонким липидным слоем. Так эксперименты Франклина оказались впереди современных биофизических изысканий. 1925-м годом датируется идея бислойности мембраны: Гортер и Грендель обнаружили, что монослой липидов, выделенных из мембран эритроцитов, ровно вдвое превосходит площадь поверхности самих клеток.

Однако тогда же было замечено, что мембрана содержит значительное количество белков, которые сильно влияют на ее свойства (в частности, поверхностное натяжение). Это открытие повлекло появление концепции мембраны-«сендвича» (Доусон и Доннелли, 1935), согласно которой липидный бислой, как слой масла в бутерброде, заключен между двумя слоями белка. Прошло не одно десятилетие, пока точные данные по соотношению белков и липидов в мембранах различных клеток и современные методы исследования (такие как рентгеноструктурный анализ и электронная микроскопия) не доказали ошибочности этого представления: на самом деле, белки не окружают бислой, — они в него «встроены», подобно элементам мозаики.

Эта метафора дала название последней «классической» теории строения мембраны: «жидкостно-мозаичная мембрана» [3]. Согласно этой теории, мембрана представляет собой липидный «океан», в котором, подобно айсбергам, плавают молекулы мембранных белков. Сравнение с океаном появилось из-за того, что агрегатное состояние липидов в мембране жидкое, а точнее — жидкокристаллическое. Мембрана сравнительно свободно «течет» в плоскости, в то время как вне нее — строго упорядочена геометрией двойного молекулярного слоя.

«Последней классической» эта теория здесь названа потому, что, с одной стороны, она явно устарела, а с другой — современные представления не достигли еще той лаконичной изящности, чтобы их начала запросто можно было изложить в школьном учебнике [4].

Почему мембрана клетки «жидкая»?

Текучесть липидной фазы мембраны обусловлена присутствием в углеводородных цепях большинства структурных фосфолипидов минимум одной ненасыщенной связи, понижающей температуру плавления липида. Проследить такое фазовое поведение достаточно просто на примере растительного масла и маргарина: первое при комнатной температуре жидкое (содержит жиры, включающие ненасыщенные жирные кислоты, — например, триолеин [T_{плавления} = 5 °C]), второй же, получаемый из растительного масла гидрированием, твердый (двойные связи ацильных цепей насыщены; для соответствующего насыщенного жира — стеарина — T_{плавления} = 55 °C (!)).

Полиненасыщенные жирные кислоты (в изобилии присутствующие в рыбьем жире) обладают еще более уникальными свойствами: они поддерживают липидный матрикс мембран в «рабочем» состоянии в широком диапазоне температур, что позволяет рыбам быстро погружаться в холодные слои и всплывать обратно. Кстати, эти уникальные качества полиненасыщенных жирных кислот полезны и для человека.

В настоящее время стало понятно, что липидный компонент мембраны — это не просто пассивный носитель белков, которые и выполняют всю работу, но равноправный участник большинства биохимических процессов. На поверку оказывается, что липидный состав мембраны (а она состоит отнюдь не из одного типа молекул липидов!) тщательно оптимизирован эволюцией и позволяет создать необходимые условия для корректной и эффективной работы мембранных белков. Например, частичное взаимное несмешивание липидных компонентов мембраны эукариотической клетки приводит к появлению микроскопических (строго говоря, даже наноскопических) неоднородностей, называемых также мембранными рафтами (от англ. raft — «плот»). Такое сложное фазовое поведение липидного матрикса мембраны активно используется клеткой: упомянутые рафты, предположительно, образуют функциональные платформы, в которых комплексы мембранных белков выполняют все разнообразие своих функций, причем определенные белки предпочитают находиться в рафтовых областях, тогда как другие — в областях между ними.

В данной статье мы постарались осветить современные представления о биофизике липидных компонентов биологических мембран, и в первую очередь, подробнее остановиться на способности липидов к самоорганизации, которая широко используется клетками в своих нуждах.

Рисунок 1. Разнообразие липидов — компонентов клеточных мембран. «Комбинаторное» построение большинства липидов (то есть, сочетание разных гидрофобных, гидрофильных и «адапторных» фрагментов) приводит к тому, что в клетке обнаруживается до 1000 разновидностей липидных молекул. Подавляющее большинство из них играет регуляторную роль, либо их роль не изучена. На рисунке показаны только некоторые основные типы липидов, встречающихся в биологических мембранах.

Многообразие биомембран

Не удивительно, что мембраны клеток разных организмов отличаются между собой. Подробное сравнение липидной составляющей различных мембран наводит на мысль, что эти различия носят принципиальный характер, и что «липидный портрет» той или иной мембраны во многом определяет ее функции (помимо «населяющих» эту мембрану белков) [5]. Так, мембраны бактерий отличаются от мембран эукариот тем, что в состав первых входит большое количество отрицательно заряженных фосфолипидов (например, фосфатидилглицеролы), тогда как вторые в основном содержат липиды цвиттерионной природы (то есть, обладая как отрицательным, так и положительным зарядом, в целом они электронейтральны), — например, фосфатидилхолины. Это фундаментальное отличие используется системой врожденного иммунитета многих эукариот, — например, антимикробные пептиды селективно разрушают мембраны бактерий именно благодаря наличию отрицательного заряда на их поверхности [6], [7], а Toll-подобные рецепторы распознают бактериальные патогены благодаря компонентам их клеточной стенки (липиополисахаридам) [8], [9]. (Химическая структура упоминаемых липидов приведена на рис. 1.)

Другая важная особенность эукариот — холестерол (известный также как холестерин), отсутствующий в прокариотических мембранах. Вопреки своей дурной славе у обывателей [12], холестерол играет важнейшую и еще, видимо, не до конца осознанную роль в работе мембран наших клеток (не говоря уже о том, что он является предшественником половых гормонов). Вместе со сфинголипидами (такими как сфингомиелин) холестерол образует рафтовые структуры, придающую эукариотическим мембранам прочность и особую функциональную гетерогенность, о чем подробнее будет сказано ниже.

Интересно, что липидный состав разных органелл существенно отличается (рис. 2). Например, липидный состав митохондрий и пластид гораздо больше напоминает бактериальный, нежели эукариотический, подтверждая тем самым химерную гипотезу становления эукариот (эукариогенеза), согласно которой эти органеллы — бывшие бактерии, захваченные во «внутриклеточный плен» путем фагоцитоза какими-то ранними формами эукариот [13]. В эндоплазматическом ретикулуме, являющемся «стартовой точкой» метаболизма большинства липидов, состав обоих листков мембраны примерно одинаковый, однако в аппарате Гольджи, плазматической мембране и эндосомах различия уже весьма существенны, что говорит о наличии активных процессов, создающих эту асимметрию. В частности, фосфатидилсерины (ФС) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ) в норме присутствуют только в цитоплазматическом листке плазматической мембраны. Наличие ФС на поверхности клетки может говорить о злокачественном перерождении и запускает программы фагоцитоза и сворачивания крови.

Рисунок 2. Липидный состав различных мембранных структур клеток млекопитающих. Диаграммы показывают липидный состав некоторых клеточных мембран; содержание холестерола (ХОЛ) дано в отношении к суммарному количеству фосфолипидов (ФЛ). Внутри клетки обозначены места синтеза основных фосфолипидов (голубые овалы) и сигнальных липидов (красные овалы) (последних по массе не более 1% от фосфолипидов, за исключением церамидов (Цер)). В эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) синтезируются в основном глицерофосфолипиды, жиры, холестерол и церамиды. Аппарат Гольджи является «поставщиком» сфингомиелина и сложных гликосфинголипидов. Около половины липидов митохондрий (в основном, фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидной кислоты (ФК) и кардиолипина (КЛ)) синтезируется этими органеллами автономно, что, вместе с типично «бактериальным» липидным составом их мембран, говорит в пользу химерной теории эукариогенеза.
Условные обозначения: БМФ — бисмоноацилглицерофосфат; ГалЦер — галактозилцерамид; ГСЛ — гликосфинголипиды; ДАГ — диацилглицерол; КЛ — кардиолипин; СМ — сфингомиелин; ТГ — триацилглицеролы (жиры); ФГ — фосфатидилглицерол; ФИ — фосфатидилинозитол; ФК — фосфатидная кислота; ФС — фосфатидилсерин; ФХ — фосфатидилхолин; ФЭ — фосфатидилэтаноламин; Хол — холестерол; Цер — церамид; PI(?)P — фосфатидилинозитолфосфаты; S1P — сфингозин-1-фосфат; Ост. — остальные липиды.

Совершенно уникальной организацией мембран обладают архебактерии — третий «домен» жизни [10], [11], наряду с бактериями и эукариотами. Эволюционно они считаются более близкими родственниками эукариот, нежели бактерий, хотя по строению липидов мембраны этого не скажешь [14]. Видимо, как адаптация к экстремофильности (способности обитать при высокой температуре и/или солености и/или кислотности), мембраны архей содержат липиды с нетипичным химическим строением (см. рис. 1):

Из всего сказанного следует, что липидный состав мембран отнюдь не является чем-то выбранным раз и навсегда [15]: он претерпел существенные изменения в процессе эволюции. Даже в разные периоды жизни одного и того же организма состав мембран может существенно варьировать. По всей видимости, липидную организацию мембран эукариот можно считать эволюционно наиболее прогрессивной, поскольку она обеспечивает максимально гибкую адаптацию микроскопического окружения под нужды белковых молекул, создавая частично изолированные области в пределах одной, казалось бы, жидкой фазы. Далее мы остановимся на этих аспектах функционирования гетерогенной эукариотической мембраны подробнее.

Латеральная гетерогенность эукариотических мембран

Что же заставило исследователей обратить внимание на то, что мембрана — это нечто более сложно устроенное, нежели липидный «океан», в котором плавают «айсберги» белков, согласно модели Сингера-Николсона? Можно сформулировать три основных аргумента, почему клеточная мембрана должна быть устроена более сложно и организованно, чем это было принято считать в те годы:

В практическом смысле вышеперечисленное обозначает, что липидная компонента, будучи жидкой, тем не менее, способна образовывать частично изолированные области бислоя, обладающие особыми структурными свойствами. Эти участки представляют собой кластеры («островки») молекул липидов, сравнительно более упорядоченные и «твердые», чем окружающая их более «жидкая» фаза. В конце 1990-х такие кластеры получили уже упомянутое название рафтов [17], и то же самое название было дано новой теории организации биологических мембран.

Сосуществование двух жидких липидных фаз — относительно более и менее упорядоченной — оказывается возможным, если липидная смесь содержит как минимум три компоненты: «легкоплавкий» липид (низкая температура плавления, ненасыщенные хвосты), «тугоплавкий» липид (температура плавления выше физиологической, насыщенные хвосты и/или высокая склонность образовывать водородные связи с соседями), а также холестерол. «Тугоплавких» липидов в эукариотической мембране немного, потому что иначе она была бы гелеобразной массой вроде маргарина: основным является сфингомиелин (производное церамида, рис. 1).

Основной фосфолипид плазматических мембран эукариот — пальмитоилолеилфосфатидилхолин (ПОФХ) — содержит двойную связь в остатке олеиновой кислоты, и этого уже оказывается достаточно, чтобы температура плавления этого липида снизилась до −3 °C (по сравнению с его полностью насыщенным аналогом — дипальмитоилфосфатидилхолином (ДПФХ), — температура фазового перехода которого составляет 41,5 °C).

Рисунок 3. «Жидкое упорядоченное» состояние липидов в модельных мембранах. а — Фазовая диаграмма тройной смеси холестерола (Хол), сфингомиелина (СМ) и пальмитоилолеилфосфатидилхолина (ПОФХ) (при 23 °C). Цветные области соответствуют составам, при которых мембрана пребывает в жидком состоянии. Сосуществование жидкой упорядоченной (L_o) и жидкой неупорядоченной (L_d) фаз показано синим цветом: здесь при увеличении концентрации холестерола в диапазоне 10–35% размеры доменов «жидкой упорядоченной» фазы постепенно увеличиваются. б — Образование макроскопических мембранных доменов в гигантских везикулах, состоящих из насыщенного (ДПФХ) и ненасыщенного (ДОФХ) фосфолипидов, а также холестерола. Домены окрашиваются флуоресцентными красителями, «предпочитающими» упорядоченную (L_o) или неупорядоченную (L_d) фазы. При увеличении концентрации холестерола сверх 16% макроскопических доменов уже не заметно, но разделение L_o/L_d продолжает существовать, о чем говорит низкий сигнал резонансного переноса энергии между молекулами красителя разных типов, находящихся в разных доменах (примерное положение двух верхних микрофотографий везикул обозначено справа желтым кругом).

Такая тройная смесь «туго-» и «легкоплавкого» липидов с холестеролом демонстрирует сложное фазовое поведение (рис. 3). По всей видимости, молекулы холестерола играют роль «центров кристаллизации» для доменов из «тугоплавких» липидов, однако его присутствие в то же время не позволяет им образовать твердую (гелевую) фазу. Чтобы точнее понять возможные фазовые состояния в мембране и сложных липидных смесях, ее изображающих, введем следующие обозначения:

Равновесие между L_o/L_d фазами было давно показано на искусственных мембраноподобных системах (например, гигантских везикулах, изготовленных из липидов легочного сурфактанта) (рис. 3б), однако непосредственно в биологической мембране такого разделения (а, значит, и рафтов) пронаблюдать долгое время не удавалось. В чем же дело, если липидный состав искусственных мембран был подобран максимально похожим на мембраны настоящие?

Проблема заключается в том, что в биологических мембранах жидкая упорядоченная фаза сильно «раздроблена», и максимальный размер рафтов не превышает 100 нм, что недоступно для непосредственного наблюдения в оптический микроскоп. (Даже флуоресцентная конфокальная микроскопия, делающая «видимыми» отдельные светящиеся молекулы, в данном случае не сможет сказать, находятся ли определенные белки и пептиды в пределах одного кластера или нет.) Причины, в силу которых в живой клетке рафты не сливаются в крупные домены, видимые в оптический микроскоп (а именно это и происходит в искусственных мембранах), мы обсудим чуть дальше.

Рисунок 4. Рафтовые неоднородности в мембране различного масштаба. а — Нанокластеры холестерола, сфингомиелина, гликосфинголипидов и белков плазматической мембраны различаются по составу. Считается, что в эти кластеры входят ГФИ-заякоренные белки, трансмембранные (ТМ) белки, специфичные для рафтов, и цитоплазматические белки, связанные с актиновыми филаментами. «Обычные» ТМ-белки не входят в состав рафтов. б — В ответ на внешние сигналы нанокластеры могут сливаться с образованием рафтовой платформы, важной для ТМ передачи сигналов и мембранного транспорта. в — Рафтовая фаза, видимая в микроскоп (ø ≈1 мкм), наблюдается исключительно в равновесных мембранных системах, таких как гигантские синтетические или мембранные везикулы. В «нативных» мембранах постоянный обмен веществом и энергией «дробит» рафтовую фазу до субдифракционных размеров.

На маленьком липидном плоту

Гипотеза рафтов восходит к наблюдению, что гликосфинголипиды в комплексе Гольджи распределены не равномерно, а кластеризуются вместе перед тем, как направляться к полюсам поляризованных эпителиальных клеток. Лабораторное изучение этих кластеров показало, что, в отличие от «обычных» участков мембран, эти кластеры не растворяются в детергенте тритон X-100: они более прочные и устойчивые. Согласно химическому анализу, эти кластеры состоят преимущественно из холестерола и сфингомиелина (рис. 1), а основные белки, неизменно попадающие в эти кластеры — это гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ)-заякоренные белки (GPI-anchored proteins). Было сделано предположение, что эти плотные кластеры образуют стабильные «плоты» (размером примерно 50 нм), в которые встроены определенные типы белков. Дополнительно в пользу этой концепции говорил тот факт, что синтетические мембраны, содержащие холестерол и гликосфинголипиды, демонстрируют примерно те же свойства: липиды разделяются на две несмешивающиеся фазы, которые даже можно разглядеть в микроскоп (рис. 3б).

Однако с течением времени стало понятно, что такое представление — противоположная крайность по сравнению с жидкостно-мозаичной моделью Сингера и Николсона: рафты далеко не столь стабильны, как это было постулировано первоначально. По всей видимости, это динамические структуры, постоянно обменивающиеся молекулами липидов и белков с остальной частью мембраны. При этом липиды в рафтах упакованы гораздо более плотно и структурированно, нежели в окружающей «жидкой» мембране. Сравнительно современное определение рафтов звучит так:

Мембранные рафты — это маленькие (10–200 нм), гетерогенные и очень динамичные липидные кластеры (или домены), обогащенные холестеролом и сфинголипидами, и принимающие участие в клеточной компартментализации. В некоторых случаях рафты могут стабилизироваться за счет белок-белковых и белок-липидных взаимодействий, формируя более крупные «рафтовые платформы» [19].

Модель рафтовой гетерогенности показана на рис. 4.

Однако, несмотря на то, что определение рафтам дано, само их существование представлялось до недавнего времени довольно-таки спорным, то есть — не подтвержденным в прямом эксперименте. Как же понимать этот парадокс?

Дело в том, что существование мембранной фракции, не растворимой в детергентах — это еще не повод считать эту фракцию рафтами (функциональными неоднородностями). Непосредственное же изучение этих доменов затруднено в связи с тем, что рафты очень сложно наблюдать «напрямую» из-за их малого размера: типичный их предполагаемый диаметр меньше дифракционного предела оптической микроскопии (≈200 нм). (Здесь речь идет именно об оптическом, а не рентгеновском или электронном излучении, потому что только оно позволяет наблюдать за клеткой неинвазивно, то есть — не разрушая ее.) Правда, в последние годы уже появились экспериментальные методики непосредственного наблюдения рафтовых кластеров (см. таблицу). В частности, одна из разновидностей оптической микроскопии сверхвысокого разрешения — наноскопия индуцировано-истощенного излучения (stimulated emission depletion, STED) — позволила установить, что ГФИ-заякоренные белки в течение достаточно длительного времени (10–20 мс) захватываются в сфинголипидно-холестерольные домены размером

Рисунок 5. Микроскопия подавления индуцированного излучения (STED) — инновационный способ неинвазивного наблюдения липидной динамики мембран в наномасштабе. STED-микроскопия — один из ультрасовременных оптических методов сверхвысокого разрешения, позволяющих «заглянуть за» дифракционный барьер (то есть, различать объекты, меньшие ≈200 нм). Образование «упорядоченной жидкой» фазы (L_o) связано с образованием доменов, обогащенных холестеролом и сфингомиелином, что можно установить при помощи метода флуоресцентно-резонансного переноса энергии (FRET). Однако размер зоны, в пределах которой «обычный» конфокальный микроскоп (слева) позволяет различать детали (≈250 нм), оказывается слишком велик, чтобы точно определить, движутся ли две молекулы совместно (то есть, образуют домен) или независимо. STED-микроскопия с размером «зоны наблюдения» всего 50 нм (справа) позволила установить существование холестерольно-сфингомиелиновых доменов на живых клетках, положив конец спору о существовании рафтов в живых клетках.

Внизу. Принцип STED-методики сходен с конфокальной флуоресцентной микроскопией, но здесь, кроме возбуждающего лазерного импульса (слева), запускающего свечение молекул-флуорофоров, используется также кольцевой формы гасящий импульс (в центре), уменьшающий эффективный радиус зоны возбуждения флуорофоров до ≈50 нм (справа; это в 4–5 раз меньше пресловутого «дифракционного барьера»).

1 мкс

5–10 нм (расстояние между флуорофорами) / а ) нм / а ) нм /

Кластеризация липидов in silico

Современные методы молекулярного моделирования позволяют изучить процесс самоорганизации липидных смесей с разной степенью детализации. Расчеты молекулярной динамики (МД; [7], [22]) модельных мембран, в которых все атомы липидов и окружающего растворителя представлены в явном виде, дают наиболее полную информацию. И хотя при таком подробном рассмотрении системы, доступные для моделирования даже на современных суперкомпьютерах, ограниченны в своих размерах (10 2 –10 3 молекул липида) и длительности наблюдения за их динамическим поведением ( −6 c), получаемые результаты дают атомарную картину возникновения мембранных неоднородностей в наномаштабе. Даже в случае однокомпонентной липидной мембраны ее поверхность не является однородно полярной, как это можно предположить из схематического представления липидов в виде «шариков с хвостиками» — часть этих «хвостиков» всплывает на границу вода—мембрана и формирует гидрофобные участки (рис. 6). В итоге мы имеем мозаично организованную поверхность, на которой в полярном «море» рассредоточены гидрофобные «островки» размером до нескольких нм 2 [23].

Рисунок 6. Мозаичная организация поверхности простейшей однокомпонентной мембраны. Слева представлена идеальная модель мембраны, справа — поверхность полноатомной мембраны (ДОФС), раскрашенной по гидрофобности.

При смешивании двух компонентов, например насыщенного (дипальмитоил-) и ненасыщенного (диолеил-) фосфатидилхолинов (ДПФХ и ДОФХ, соответственно), картина усложняется, и наблюдается обособление более «твердой» фазы (ДПФХ) в стабильные нанокластеры, распределенные диффузно в плоскости мембраны [24]. При моделировании трехкомпонентных мембран, в состав которых входят холестерол, сфингомелиеин и ДОФХ даже на небольших временах МД (2×10 −7 с) наблюдается настоящее фазовое разделение, при котором «тугоплавкий» сфингомелеин формирует островок, по границе которого располагается холестерол, обращенный своей «щетинистой» стороной во внешнюю фазу «легкоплавкого» ДОФХ [25].

Увеличить время наблюдения за поведением многокомпонентных мембран in silico, а также размер моделей, позволяет упрощенное («крупнозернистое») описание молекул. Атомы объединяют в обособленные группы — «зерна» (обычно 3–4 атома), — для которых производят расчет МД. Такая методика позволила впервые «увидеть» разделение L_o/L_d фаз в мембране из нескольких тысяч молекул, содержащей 40% насыщенного ДПФХ, 30% ненасыщенного дилинолеилфосфатидилхолина (ДЛФХ) и 30% холестерола, моделируемых в течение 20 мкс [26]. Более того, если к такой модельной мембране добавить трансмембранные спиральные пептиды (минимальные «строительные блоки» большинства мембранных белков), то можно наблюдать, как происходит их сортировка между фазами — моделируемые фрагменты белка предпочитают находиться в более жидкой L_d-фазе (ДЛФХ) и избегают упорядоченной L_o-фазы ДПФХ (рис. 7) [27].

Стоит отметить, что возникновение латеральной гетерогенной структуры в мембране наблюдается не только при смешивании «тугоплавких» и «легкоплавких» липидов, но также любых других отличающихся по своим физико-химическим свойствам — например, заряду полярной головки и склонности образовывать водородные связи с соседями. В частности, в модельной бактериальной мембране, содержащей 70% фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и 30% отрицательно зараженного фосфатидилглицерола (ФГ) также наблюдается формирование нанодоменов, — за счет того, что молекулы ФЭ эффективно взаимодействуют друг с другом и вытесняют «невыгодного» партнера ФГ. На «крупнозернистых» моделях была показано, что такая латеральная организация мембран бактерий используется в процессе связывания антимикробными пептидами, которые при этом вызывают рост доменов ФГ и возникновение фазового разделения [28].

Что ограничивает размер рафтов в биомембранах

В реальных экспериментальных системах наблюдается достаточно парадоксальный контраст с искусственными мембранами, разделение фаз L_o/L_d в которых наблюдали неоднократно и при разных условиях. В живой клетке это удалось сделать непосредственно лишь недавно, да и то — используя самые современные технологии субдифракционного наблюдения [21]. В чем же причина такого разительного отличия?

Ведь на границе рафтовой фазы создается поверхностное (линейное) натяжение, а значит, присутствует избыточная свободная энергия, снизить которую можно путем слияния отдельных «плотиков» в одну большую макрофазу. Примерно то же самое наблюдается в супе, мелкие капли жира на поверхности которого постепенно объединяются в более крупные пятна. Фактически, это самое и происходит в искусственных мембранах (например, в мембранных везикулах) — самопроизвольный термодинамический процесс толкает к глобальному разделению L_o и L_d фазы. Но это обозначает, что отсутствие в живой клетке крупных L_o-кластеров — следствие активных процессов, протекающих с затратой энергии. (Возвращаясь к аналогии с супом, мы никогда не увидим одного большого пятна жира в кипящей кастрюле.) С одной стороны, это может происходить «само», поскольку мембрана, как и сама жизнь, — система, далекая от термодинамического равновесия. С другой стороны, эволюция физико-химических свойств мембраны могла направленно выработать такое приспособление, поскольку оно позволяет мембранам выполнять свои функции более эффективно.

Так или иначе, в мембранах протекает ряд процессов, постоянно «дробящих» рафты, — именно поэтому их так долго и не могли с достаточной степенью уверенности «нащупать». Это постоянный обмен веществом и энергией — ведь мембраны представляют собой открытые системы: помимо многочисленных разновидностей везикулярного транспорта, отдельные фрагменты мембраны постоянно «заглатываются» внутрь клетки и после какой-то переработки возвращаются обратно. Кроме этого, специальные белки делят мембрану, подобно «заборчикам», на отдельные участки. С одной стороны, это способствует компартментализации, с другой — также препятствует росту рафтов.

Анализ огромного массива биохимических и биофизических данных относительно липидных доменов в биомембранах, накопившихся за последние 15 лет, привел ученых к выводу, что состав липидного матрикса мембран эволюционно подобран, чтобы при физиологических условиях всегда находиться вблизи фазового перехода (рис. 8). Это способствует образованию в мембранах мезофазы (рафтов), которые, несмотря на свой малый размер и динамическую природу, играют важную (хотя не до конца еще изученную) роль. Какую? Читайте в заключительной части статьи.

Рисунок 8. Динамическая модель рафтов. Домены «жидкой упорядоченной» фазы (L_o) в мембране гетерогенны как по размеру, так и по времени существования (0,1 мс — 1 с, показано цветом): это зависит от размера, липидного состава и «захваченных» белков, способных стабилизировать рафт. (Длина пунктирных стрелок, изображающих латеральную подвижность доменов, пропорциональна времени жизни.) Маленькие L_o-домены формируются спонтанно и диффундируют в плоскости мембраны (a). Захватив ГФИ-заякоренный или другой рафтовый белок (b), такой домен становится стабильнее и образует комплекс (c), способный или просто распасться (d), или, слившись с другим, увеличить размер (e). Такие столкновения могут привести к формированию более крупного и стабильного L_o-белкового комплекса (f), либо через какое-то время распадающегося самостоятельно, либо захватываемого в эндоцитозный пузырек (h) и «разбираемого» на исходные составляющие (i). Таким образом, рафтовые платформы в биомембранах, хотя и выполняют важные функции, являются динамическими структурами, постоянно возникающими и пропадающими вновь.

Биологическая роль наноразмерных неоднородностей в мембране

Роль такого сложного фазового поведения липидного матрикса мембран еще только предстоит понять в полной мере. Впрочем, сегодня ясно главное — такие свойства позволяют группировать (сортировать) разные белки в частично изолированные области, что позволяет им выполнять предназначенные функции. Также эти свойства определяют то, каким образом мембраны делятся и сливаются, — а это и деление самих клеток, и везикулярный транспорт, и жизненный цикл вирусов, и способность многих токсинов проникать внутрь клеток. Рассмотрим несколько примеров биологической роли рафтов немного более подробно [20]:

Перспективы биофизического изучения мембран

Кажущаяся простота липидного «океана» осталась в прошлом, и сейчас исследователи лишь приблизительно представляют все молекулярные тонкости образования кластеров в липидах. Точно так же далек от понимания и механизм «сортировки» одних белков в рафтовую фазу, а других — в более жидкую область мембраны. Между тем, это понимание дало бы возможность создать стратегию рафт-селективной доставки в клетку различных веществ, — в том числе, лекарств.

Все рассказанное в этой статье относится в первую очередь к мембранам эукариот, — но это еще не обозначает, что у бактерий нет ничего подобного (раз нет и холестерола). Изучение латеральной неоднородности бактериальных мембран может привести к созданию новых поколений антибиотиков, избирательно уничтожающих патогенные микроорганизмы, и свободных от проклятия резистентности, давно уже нависшего над «традиционными» антибактериальными средствами.

История с изучением липидного матрикса мембран в очередной раз показывает, что живая материя устроена значительно сложнее, чем представлялось ранее, и изобретение новых высокоточных методик наблюдения лишь усугубляет эту сложность.

Статья написана в соавторстве с Антоном Полянским и при поддержке РФФИ (конкурс на написание научно-популярных статей), № проекта: 11-04-11516-с. В сокращенном виде она опубликована в «Природе» [31].

Источник