На основании чего проводится выбор подозрительной колонии бактерий
Бактериологический метод
Суть бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя и его дальнейшей идентификации, т.е. установления видовой принадлежности по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам, отношению к бактериофагам, бактериоцинам и т.д.
Бактериологический метод распадается на несколько этапов:
а) ориентировочное бактериоскопическое исследование (проводится не при всех исследованиях);
б) выделение искомого возбудителя в чистой культуре;
в) идентификация выделенного в чистой культуре возбудителя.
Выделение чистой культуры проводится в 3 этапа.
1-й этап исследования
Выделение чистой культуры может проводиться двумя путями:
а) посевом на плотные питательные среды – здесь имеется выигрыш во времени. В качестве плотных питательных сред для рассева исследуемого материала чаще берут МПА, элективно-селективные и дифференциально-диагностические среды;
На практике, как правило, используют оба эти способа параллельно.
Следует отметить, что отбор подозрительных колоний – ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на характере роста колоний микробов. Однако одна характеристика колоний не всегда позволяет дифференцировать микроорганизмы, поэтому приходится проводить дополнительное изучение морфологии микробов в мазках из подозрительных колоний, на дифференциально-диагностических средах учитывать ферментативную активность, а иногда прибегать к изучению антигенной структуры.
3-й этап исследования
А. Контроль чистоты культуры на скошенном питательном агаре):
1) визуальный (рост культуры должен быть однородным, гомогенным;
Б.Идентификация выделенной чистой культуры.Для этого используют морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные особен-
ности, антигенные свойства, фагочувствительность, вирулентность и т.д..
Принадлежность к классу, порядку, семейству, иногда даже к роду можно установить на основании морфологии и тех сведений предварительного изучения, которые мы получаем в ходе выделения чистых культур.
Чтобы определить род микробов, в большинстве случаев необходимо знание их физиолого-биохимических признаков. Проводится определение совокупности нескольких тестов
Морфология бактерий изучается обязательно в мазке из культур, окрашенном по методу Грама, иногда – в дополнительных мазках, окрашенных специальными методами. Подвижность определяется, как правило, посевом уколом в столбик хорошо осветленного полужидкого агара (рост по уколу говорит о том, что микробы неподвижны, рост с помутнением – что они подвижна). Чаще подвижность изучают путем микроскопии препаратов «висячей» или «раздавленной» капли.
Культуральные свойства изучаются в процессе выделения чистой культуры микроорганизмов они включают сведения о характере колоний, о росте на поверхности скошенного агара по штриху, о росте на жидких средах. Специально изучается, например, валообразование у сальмонеллы паратифа В или ползучий рост у протея.
Антигенная структура. Бактериальная клетка обладает сложной антигенной структурой, что часто выражается в виде антигенной формулы. У многих микроорганизмов имеется О-антиген, Н-антиген, К-антиген. Как правило, антигенная структура изучается путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием в качестве антител иммунных диагностических видовых и типовых сывороток.
Предварительная принадлежность к роду или группе видов может быть определена с использованием поливалентных сывороток.
Если используется неадсорбированная видовая сыворотка, положительная реакция на стекле дополняется развернутой пробирочной – для исключения возможной положительной реакции за счет групповых антител.
Фаголизабельность определяется путем постановки реакции фаголизиса с использованием видового индикаторного бактериофага. В случае наличия фаготипов микроба-возбудителя определение ведется в тех же реакциях, но с использованием типового индикаторного бактериофага.
Изучение патогенности на лабораторных животных проводится не всегда, т.к. тест малодоступен, продолжителен по времени. Он применяется, главным образом, при диагностике ООИ. На практике обычно ограничиваются определением отдельных факторов вирулентности: гемолитической, плазмокоагулирующей активности, выявлением экзотоксина в реакции преципитации в агаре и т.д.
4-й этап исследования.Учет полученных результатов и выдача ответа.
Бактериоскопический (микроскопический) метод
Суть бактериоскопического метода: обнаружение микробов в исследуемом материале; изучение их морфологических и тинкториальных свойств, характер расположения в бактериологическом мазке в поле зрения.
Техника выполнения. Материал от больного визуально изучается, выбирается порция, в которой с наибольшей долей вероятности может быть обнаружен возбудитель заболевания (комочки слизи, гнойные пробки). Он наносится на предметное стекло (иногда материал предварительно эмульгируется в физиологическом растворе, реже подвергается центрифугированию). Капля распределяется по стеклу, высушивается и фиксируется. После этого мазок окрашивается, и препарат просматривается под микроскопом. Обычно мазок окрашивается по Граму. Иногда, как наиболее щадящий, применяется один из простых методов окраски, тогда препарат красится одним красителем (например, при диагностике менингококковой инфекции, холеры).
При необходимости используются специальные сложные методы окраски, например метод Бурри-Гинса для выявления капсульных микроорганизмов или метод Циля-Нильсена для выявления наличия кислотно-устойчивых бактерий. В отдельных случаях (в частности, при изучении двигательной активности микроорганизмов) готовят препараты «висячая капля» и «раздавленная капля» и микроскопируют неокрашенные бактерии.
Достоинства бактериоскопического метода: простота исполнения, возможность быстрого получения результатов, техническая и экономическая доступность.
Недостатки метода:для определения вида микроорганизмов зачастую бывает недостаточным определение его морфологических свойств, так как они идентичны у представителей родственных видов. Кроме того, бактерии с характерной морфологией нередко подвергаются изменениям, особенно под действием антибиотиков, и становятся неузнаваемыми; наконец, концентрация возбудителей в исследуемом материале может быть чрезвычайно низкой, и тогда их трудно обнаружить.
С учетом вышеуказанного, бактериоскопический метод редко используется как единственный и окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он применяется как ориентировочный, предварительный, а при диагностике некоторых инфекционных заболеваний он вообще не предусматривается.
Как понимать ориентировочность и предварительность? Это касается врача-клинициста и врача-бактериолога. Клиницист, получая предварительный ответ (положительный или отрицательный), в большей или меньшей степени использует полученную информацию в своих дальнейших исследованиях до получения окончательного результата бактериологического метода диагностики. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о подозреваемом возбудителе, о его концентрации в используемом материале, о наличии сопутствующей микрофлоры, определяет способы обработки материала и выделения чистой культуры возбудителя, выбирает питательные среды для последующего культивирования.
Бактериологический метод
Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).
Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют биологический, аллергологический или другие методы исследования.
Достоинства бактериологического метода диагностики:высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.
К недостаткам метода можно отнести длительность исследования (не менее 4-5 дней), а также невозможность его использования в тех случаях, когда возбудители (например, риккетсии, хламидии) инфекции не растут на искусственных питательных средах.
Биологический метод
В некоторых случаях для оптимизации диагностики инфекционных заболеваний применяется биологический метод (биопроба), предусматривающий заражение лабораторных животных. При этом перед исследователем могут стоять различные цели:
— воспроизведение клинической и патологоанатомической картины заболевания (например, при диагностике столбняка, лептоспироза);
— выделение в короткие сроки чистой культуры возбудителя (при диагностике пневмококковой инфекции);
— определение вирулентности и патогенности возбудителя (при диагностике туберкулеза);
— определение вида и типа токсинов (при диагностике ботулизма)
Перед введением материала животных фиксируют. Мелких животных держит экспериментатор, для крупных используют специальные приспособления. Место введения инфецированного материала обрабатывают спиртом или йодом. Инфицированный материал вводят в зависимости от особенностей патогенеза изучаемого заболевания подкожно, накожно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально и т.д.
При накожном методе заражения предварительно выстригают шерсть, скарифицируют кожу, после чего втирают в неё материал.
Подкожный метод: кожу животных захватывают в складку, лучше пинцетом, вводят иглу до половины, после инъекции накладывают ватку со спиртом и извлекают иглу.
Внутримышечный метод: материал вводят в мышечную ткань верхней части задней конечности.
Внутрибрюшинный метод: животное держат вниз головой, чтобы не поранить кишечник. Инъекцию делают в нижней части живота, сбоку от средней линии. Брюшную стенку прокалывают толчкообразным движением, шприц под прямым углом.
Подготовка инструментов и материалов: шприцы, скальпели, иглы стерилизуются кипячением. В шприц набирают материал (немного больше, чем необходимо ввести), поворачивают вертикально вверх, покрывают иглу стерильной ваткой и выталкивают поршнем из шприца пузырьки воздуха. Эту манипуляцию проводят над дезраствором.
При диагностике инфекций, обусловленных действием токсина (ботулинического, сибиреязвенного) материал, предположительно содержащий возбудителя и токсины, помещают в физиологический раствор, затем фильтруют через бумажный фильтр, натертый тальком (он хорошо адсорбирует токсин). Чувствительных животных заражают смывами с фильтров. В некоторых случаях, когда патогенез заболевания обусловлен патогенными свойствами самого возбудителя, животных заражают микробной взвесью.
Зараженных белых мышей маркируют и помещают в специальные стеклянные банки; на них наклеивается бирка с указанием даты заражения и вида микроорганизма, с которым проводилась работа. Точно так же подписывают клетки с зараженными кроликами или морскими свинками. За животными наблюдают. В случае гибели их сразу же вскрывают.
Вскрывают брюшную полость, при внешнем осмотре отмечают состояние внутренних органов (величину, цвет, консистенцию, наличие гнойных очагов). Делают посевы печени, селезенки и мазки отпечатки.
Работа проводится стерильными инструментами, после каждого взятия органа пинцет и ножницы опускаются в стакан со спиртом и обжигают.
После вскрытия труп и кювету, где производилось вскрытие, заливают дезраствором на сутки.
Посевы инкубируют в течение 24 часов (при необходимости и более) при
t 37 о С. Затем их просматривают, выделяют чистую культуру возбудителя и осуществляют его идентификацию при помощи бактериологического метода.
Достоинства метода: достоверность полученных результатов, отсутствие необходимости в сложной аппаратуре.
Недостатки: дороговизна, ограниченность применения, опасность инфицирования.
Алгоритм описания колоний
Бактерии и их свойства: описание видов и штаммов
Описывая разновидности бактерий, ученые указывают их морфологические, биохимические, культуральные и серологические свойства.
Культуральные характеристики
Культуральную характеристику роста бактериальных колоний на питательной среде дают после их визуального осмотра. Они могут иметь массу морфологических и культуральных различий, кроме того, способны меняться с течением времени. Молодые и старые колонии бактерий всегда описывают по культуральным свойствам отдельно:
Для чего используют колонии
Обычно они используются для получения чистых культур. Чистая культура – это популяция микроорганизмов одного вида, выращенная с использованием благоприятной среды. Много видов микроорганизмов различают по какому-то специфическому признаку. Их объединяют по разным критериям на биовары (то есть биологические варианты). На фото, сделанном с применением электронного микроскопа, возможно определение многих видов микробов:
Все разновидности таких микроорганизмов можно рассмотреть на фото.
Общие критерии для определения колоний
Современная микробиология использует такие общие критерии для определения той или иной бактериальной совокупности, оценки ее структуры:
По всем этим признакам все совокупности микроорганизмов подлежат всестороннему исследованию. Такие признаки хорошо видны на фото, которые сделаны с использованием электронного микроскопа и других приборов.
Изучение микрофлоры молока
Определение бактерий имеет значение в практической деятельности человека, например, в пищевой промышленности. Так, бактериальная обсемененность молока является основным показателем санитарных условий его получения. В случае превышения порогового количества микроорганизмов в молоке, сортность продукта снижается.
С 1987 г. страны ЕЭС приняли единые стандарты по степени бактериальной обсемененности молока, подразделяя продукт на три категории:
В данном случае числа указывают на максимально возможное количество микроорганизмов в 1 мл молока (обсемененность).
Наличие в молоке соматических клеток является важным критерием качества. Эти клетки являются частичками биомассы животного. Они образуются в вымени и отражают естественные процессы старения и обновления организма.
Число соматических клеток в молоке возрастает при наличии у животных травм, заболеваний ЖКТ или других патологий, что приводит к росту показателя бактериальной обсемененности молока.
Как получают культуры
В любой микробиологической лаборатории проводится выделение культур микробов. Их необходимо иметь для правильного определения возбудителя инфекционного заболевания больного и выбрать соответствующее лечение. Врачи должны правильно определить название возбудителей, вызвавших болезнь. Без колоний от бактерий сделать это очень трудно, а иногда и невозможно.
Получить нужный штамм микробов можно при помощи посевов. Их обычно делают на жидкие питательные составы. Посев лучше всего делать в чашке Петри. Чашка Петри – это прозрачная стеклянная посуда в виде цилиндра невысокого размера. Он закрывается крышкой таких же размеров. Чашка Петри широко используется в микробиологии. Микроорганизмы, получаемые в таких сосудах, хорошо видны на фото. В чашку Петри добавляют питательное вещество и опускают биоматериал.
В чашке Петри можно также производить посев на плотную среду. В таком случае биологический материал размещают возле ее краев.
Как происходит посев в чашке Петри
В чашку Петри материал, необходимый для получения культуры, наносится петлей, пипеткой или тампоном возле ее края. Шпатель быстро (на счет «раз») проносится через пламя
Очень осторожно биоматериал распределяется по всей поверхности чашки
В чашке Петри возможен также посев при помощи укола в толщу питательного состава. При этом получается чистая совокупность микробов, и это хорошо видно на фото, сделанном с использованием микроскопа.
В прибор для получения колоний от бактерий можно также производить посев в толщу питательного раствора.
Другие способы получения бактериальных колоний
Возможно разведение колоний микробов по Коху. При этом материал, необходимый для определения, последовательно разводят (как правило, счет разведений доходит до четырех). На последнем этапе размножения в приборе, используемом для инкубации бактерий, появляются изолированные группы микробов, хорошо заметные на фото. Все такие колонии происходят из материнской клетки.
Подобная форма получения штаммов используется тогда, когда материал, подготовленный для определения, разводится в пробирке при помощи стерильного питательного бульона. Одна капля материала вносится в первую по счету чашку. Ее распределяют по всему сосуду. Далее по нему проводят стерильным шпателем, и в такой же форме делается посев во второй чашке. Эта форма существования колоний микроорганизмов позволяет получить самые чистые их штаммы, хорошо заметные на фото.
Выделение колоний в специальных приборах
Иногда для получения чистых совокупностей бактерий применяют специальные приборы. Они облегчают определение анаэробных бактерий. В таких приборах можно создать все необходимые условия для их развития.
Чаще всего используют микроманипулятор. Это прибор, который позволяет извлекать всего лишь одну клетку из суспензии при помощи микропетли. На предметном столике микроскопа устанавливается влажная камера, в которой помещен прибор «висячая капля». В таком приборе определение бактерий, их размеров, форм производится с точностью до микрона. Исследователь же может легко определить клетки, переместить их в пробирку, где имеется уже стерильная питательная жидкость. В ней получается чистый штамм той или иной бактерии.
Виды сред для выращивания бактерий
Методы выращивания бактерий с целью выявления их культуральных свойств часто требуют применения субстратов различной плотности. Различают жидкие, полужидкие и плотные питательные среды:
В зависимости от состава их делят на среды с определенным составом или синтетические, приготовленные в промышленных или лабораторных условиях из известных компонентов и те, состав которых не может быть определен точно – это растительные и животные природные субстраты (например, картофель, морковь, молоко или экстракты, полученные из них).
С точки зрения целей использования различают общие (общеупотребительные), селективные, обогащенные, специальные и дифференциально-диагностические среды:
Кипячение субстратов позволяет удалить из них кислород. Часто применяется метод выращивания анаэробов в толще питательных сред, что необходимо для выявления культуральных свойств бактерий.
На основании чего проводится выбор подозрительной колонии бактерий
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
1. РАЗРАБОТАНЫ ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (М.В.Зароченцев, В.В.Мордвинова, М.А.Ярославцева, А.А.Гарбузова).
2. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю.Поповой 4 декабря 2020 г.
3. МР 4.2.0220-20 введены взамен МУ 2657-82 «Методические указания по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами», утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 31.12.1982 N 2657.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, аккредитованных организаций, проводящих санитарно-эпидемиологические экспертизы, исследования и иные виды оценок, отбор проб, исследования и контроль за санитарно-гигиеническим состоянием и микробиологическими показателями.
1.3. Объектами, на которые распространяются настоящие МР, являются организации общественного питания населения, в том числе пищеблоки лечебных, детских, дошкольных и подростковых учреждений, торговые объекты и рынки, реализующие пищевую продукцию, предприятия пищевой промышленности, объекты по предоставлению гостиничных, бытовых, социальных услуг, услуг в области культуры, спорта, организации досуга, развлечений, продаже товаров производственно-технического назначения для личных и бытовых нужд.
1.4. При проведении исследований используются перечисленные в приложении 1 к настоящим МР питательные среды, реагенты и реактивы, а также аналогичные или с лучшими характеристиками.
МУК 4.2.2942-11 «Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях».
1.7. При проведении исследований микробной обсемененности объектов окружающей среды возможно применение альтернативных методов исследований, таких как использование петрифильмов, метода отпечатков (контактные экспресс-тесты, контактные чашки Родека, бактотест и др.), микробиологических анализаторов.
II. ОТБОР ПРОБ С ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НА МИКРОБНУЮ ОБСЕМЕНЕННОСТЬ
2.1. Отбор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов
2.2. Для контроля микробной обсемененности и эффективности санитарной обработки смывы с объектов окружающей среды проводят до начала работы, либо во время производственного процесса после проведения надлежащей обработки поверхности. В случае необходимости выявления источника обсеменения при установленной микробной контаминации отбор производят с необработанных поверхностей.
2.3. Техника взятия смывов
При отборе смывов с поверхности необходимо использовать стерильный тампон, увлажненный стерильной пептонной водой (пункт 1 приложения 1 к настоящим МР), внесенной в каждую пробирку в количестве не менее 2,0 мл. Допускается смачивание тампона (материала для отбора) стерильным изотоническим раствором хлорида натрия или иной допустимой транспортной средой, а также использование стерильных зонд-тампонов (свабов, тупферов и т.д.) промышленного производства. Тампон увлажняют наклонением пробирки или опусканием тампона в жидкость непосредственно перед взятием смыва.
В случае применения дезинфицирующего агента используется нейтрализатор дезинфицирующих средств. В зависимости от применяемого дезинфицирующего агента в качестве нейтрализатора допускается использование стерильных растворов химических веществ, например:
Взятие смывов для предприятий, выпускающих и реализующих пищевые продукты производится в первую очередь с зон контакта поверхности с продукцией и/или зон хвата руками для прочих объектов (приложении 2 к настоящим МР).
Рекомендации по взятию смыва:
— смывы с площади меньше или равной 10х10 см (100 см ) отбирают стерильным тампоном с хлопком или синтетическим материалом;
— при отборе смывов с площади более 100 см следует использовать салфетку (5*5 см);
— смывы с перчаток берут только с наружной стороны ладонной поверхности перчатки;
— при взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, потом протирают межпальцевые пространства, ногти и подногтевые пространства;
— если при взятии смывов с ровной поверхности используются металлические рамки-трафареты, ограничивающие площадь взятия смывов, то такие рамки-трафареты должны быть стерильны.
При взятии смывов составляется документ, включающий в себя информацию, необходимую для однозначной идентификации объекта, места взятия, основания и условий отбора, даты и времени взятия проб, условия и сроки доставки и иные дополнительные сведения (например, техническое и санитарное состояние оборудования, инвентаря, посуды и т.п.). Документ подписывают специалист, проводивший отбор, представитель объекта, на котором производилось взятие смывов, иные заинтересованные лица.
Время доставки смывов в лабораторию не должно превышать 6 часов с момента взятия, если иное не валидировано аккредитованной лабораторией в установленном порядке, как обеспечивающее достоверный результат.
III. МЕТОД ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
3.1. Бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов внешней среды предусматривает определение бактерий группы кишечных палочек (общих колиформных бактерий, термотолерантных колиформных бактерий), S. aureus, общей бактериальной обсемененности (общего микробного числа). По эпидемиологическим показаниям номенклатура исследований микробной обсемененности объектов внешней среды может быть расширена.
3.2. Методика посева смывов на бактерии группы кишечных палочек (общие колиформные бактерии, термотолерантные колиформные бактерии).
3.3. Методика посева на общую бактериальную обсемененность (общее микробное число).
3.4. Методика посева на S. aureus