Нанопоровый секвенатор что это
#39 Протокол ARTIC: нанопоровое секвенирование вирусов
Эпидемия COVID-19, охватившая нашу планету, стала очень ярким примером того какие последствия может нести случайная мутация или смена хозяина вируса, то есть процесс его эволюции.
Эволюция вируса – это накопление точечных мутаций в его геноме, возникающих при многократном самореплицировании: процессе копирования наследственной информации, с помощью которого размножается вирус. Большинство этих мутаций не влияют на свойства вируса, но некоторые могут оказаться очень значимыми и менять механизм и скорость его передачи, а также характер течения заболевания.
SARS-CoV-2 достаточно хорошо изучен: были разработаны лекарства и вакцины, и в настоящий момент население активно иммунизируют. Однако, вирус продолжает развиваться и неизвестно, будет ли приобретенный иммунитет эффективен в отношении новых мутантных форм. В связи с этим с самого начала эпидемии Всемирная Организация Здравоохранения сотрудничает с лабораториями по всему миру для обнаружения и отслеживания распространения новых вариантов вируса. В этом обзоре мы обсудим методы, которые учёные используют для исследования и поиска мутаций вирусов в лабораториях (и не только).
ARTIC network
Быстро эволюционирующие РНК-вирусы (такие как Эбола, SARS-CoV-2, грипп и т. д.) постоянно накапливают изменения в своих геномах, которые можно использовать для реконструкции процессов, вызывающих эпидемию. На сайте ARTIC в свободном доступе находятся подробные протоколы, описывающие все этапы исследования вируса от рекомендаций по забору и транспортировке материала до алгоритмов обработки результатов. Своевременное использование методов молекулярной эпидемиологии помогает выбрать наиболее подходящий путь реагирования на вспышки заболеваемости.
Методы поиска новых мутаций
Каждый из подходов имеет свои достоинства и недостатки. Так как геном вируса сравнительно небольшой, проводить расшифровку на приборах Illumina, заточенных под чтение коротких фрагментов, кажется весьма оправданным. И поскольку эта технология уже не новая, многие лаборатории имеют всё необходимое оборудование и опыт работы на приборах этого типа. Однако, есть и некоторые ограничения: секвенаторы тяжело транспортировать, а также стоимость одного запуска довольно высокая.
Готовые решения для секвенирования SARS-CoV-2.
Компания New England Biolabs разработала наборы NEBNext ARTIC для подготовки библиотек для полногеномного секвенирования SARS-CoV-2. Всего в этой линейке три набора: два для работы на Illumina и один для работы с ONT. Подробнее об особенностях каждого из наборов можно узнать на соответствующих страницах нашего сайта.
Наборы NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 от New England Biolabs:
Преимущества наборов NEBNext ARTIC SARS-CoV-2
Первым преимуществом использования готовых наборов стоит назвать сбалансированность всех реагентов. Специально подобранные буферные системы и смеси ферментов позволяют снизить количество этапов пипетирования и очистки реакции, которые могут привести к нежелательной контаминации и потере образца.
Другая важная деталь — это праймеры, входящие в состав набора. В каждый набор NEBNext ARTIC включены пары праймеров комплиментарные как наиболее консервативным областям генома SARS-CoV-2, так и некоторым участкам РНК человека, для осуществления внутреннего контроля образца. Последовательности нуклеотидов в праймерах такие же, как и в протоколе ARTIC, однако, они обладают улучшенным молекулярным строением и позволяют получить более глубокое покрытие при секвенировании.
Улучшение покрытия генома с модулем NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Oxford Nanopore Technologies. Визуализация Integrative Genome Viewer покрытия генома SARS-CoV-2. Ампликоны были созданы из 1 000 копий вирусной РНК SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 и VR-1991) в 100 нг универсальной референсной РНК человека (ThermoFisher QS0639) с использованием панели IDT ARTIC nCoV-2019 V3 («Standard») или сбалансированных пулов праймеров ARTIC SARS-CoV-2 NEBNext. Библиотеки были созданы с использованием набора NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) и наборов ONT Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) и 13-24 (EXP-NBD114), Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) и SFB Expansion Kit (EXP-SFB001).Секвенирование осуществлялось на приборе GridION с использованием проточных ячеек R9.4.1, и пайплайна ARTIC Network nCoV-19.
Кроме того, в наборах линейки NEBNext используется самая точная полимераза Q5, которая допускает в 280 раз меньше ошибок по сравнению со стандартной Taq полимеразой. Готовые смеси для амплификации библиотек секвенирования с этой полимеразой включены в набор, а также их можно приобрести в виде отдельного модуля.
А что дальше?
Когда данные секвенирования вируса получены и обработаны биоинформатиками, последовательность добавляют в одну из открытых баз данных. ВОЗ сотрудничает с такими центрами по всему миру и агрегирует эту информацию, в том числе с помощью системы GISAID. На этом сайте можно найти много интерактивных карт с информацией об обнаружении новых вариантов вируса и их распространении. Например, на этой карте можно проследить как мутировал SARS-CoV-2 за все время эпидемии и посмотреть географию распространения различных вариантов вируса.
Нанопоровый секвенатор MinION
MinION – нанопоровый секвенатор производства компании Oxford Nanopore Technologies с максимальной производительностью до 30 млрд. нуклеотидов за один запуск и без ограничений по длине прочтений!
Главные преимущества MinION
Видеообзор нанопорового секвенатора MinION
Технология нанопорового секвенирования
Ключевым компонентом (и основным расходным материалом) нанопровых секвенаторов является проточная ячейка.
Процесс секвенирования происходит в камере ячейки, содержащей непроводящую мембрану, в которую встроены проводящие белковые нанопоры. Обе стороны мембраны омывают растворы электролитов.
Во время пробоподготовки к концам фрагментов нуклеиновых кислот пришиваются специальные моторные белки. При попадании образца в камеру проточной ячейки эти белки связываются с нанопорами.
При запуске прибора между сторонами мембраны возникает разность потенциалов. Под действием электрического поля и при участии молекул АТФ моторные белки расплетают двухцепочечную нуклеиновую кислоту и направляют одну из цепей в нанопору. (При этом вторая цепь может присоединиться к соседней поре либо остаться в растворе.)
Дальнейшее движение фрагмента нуклеиновой кислоты через канал осуществляется за счет его отрицательного заряда. Одновременно с исследуемой молекулой под напряжением через нанопоры движутся ионы, содержащиеся в растворах электролитов. Поскольку размер нуклеотидов неодинаков, величина ионного тока зависит от последовательности участка нуклеиновой кислоты, проходящего через канал в данный момент времени. В ходе секвенирования происходит регистрация этого тока.
Таким образом, первичные данные нанопорового секвенирования представляют собой совокупность скачков силы тока ионов.
После секвенирования одного фрагмента нанопора остается активной и может аналогично пропустить через себя множество других цепей нуклеиновых кислот.
Бейсколлинг – распознавание нуклеотидов по исходному сигналу – осуществляет специальное программное обеспечение.
Видеообзор принципа нанопопрового секвенирования
Управление нанопоровым секвенатором MinION
Через порт USB 3.0 секвенатор MinION может быть подключен к управляющему ноутбуку или стационарному компьютеру, удовлетворяющему следующим характеристикам:
Программное обеспечение для MinION
Дополнительная программа Guppy предназначена для бейсколлинга по итогам запуска в режиме offline.
ПО MinKNOW и Guppy можно скачать бесплатно в личном кабинете на сайте Oxford Nanopore Technologies.
Первичные данные, получаемые на MinION, позволяют не только определить последовательность нуклеиновых кислот, но и получить информацию о содержании в них модифицированных нуклеотидов. Обработав эти данные специальным ПО, можно без дополнительной ручной работы с биоматериалом изучить профиль метилирования ДНК.
Задачи отечественного секвенаторостроения (июнь, 2019 г.)
Перед чтением этого апгрейда желательно ознакомиться с опубликованным ранее исходником.
Да и не только для российского. Поэтому наибольшее внимание посетителей недавней (22-24 мая) конференции компании ONT привлекло сообщение о начале продаж Flongle — адапторной вставки к секвенатору MinION, позволяющей работать с менее производительными (
1 Gb), но сравнительно дешёвыми ($90) одноразовыми ячейками.
Появление Flongle способно вызвать взрывной рост применения NGS (next generation sequencing) в клинической практике и потеснить обычную ПЦР-диагностику, объём рынка которой в России превышает миллиард рублей, а в мире измеряется миллиардами долларов. Но для большинства российских пациентов NGS-диагностика по-прежнему останется непозволительной роскошью, поскольку стоимость ячеек к Flongle на отечественном рынке будет выше 10 тысяч рублей. А если к ней добавить стоимость расходных реагентов, транспортные издержки и накладные расходы, то расчётная цена секвенирования одной пробы ДНК/РНК не опустится ниже 20 тысяч рублей.
Отсюда следует необходимость разработки отечественных нанопоровых секвенаторов и их обеспечения дешёвыми расходными материалами и реагентами.
Наноридер
Значительно удешевить нанопоровое секвенирование можно при помощи многократного использования ячеек для Flongle и импортозамещения необходимых для работы с ними расходных реагентов. Но для начала нужно обзавестись тестовым устройством, позволяющим наблюдать за формированием бислойных липидных мембран (БЛМ) на 126 лунках рабочей ячейки, и оценивать количество и качество встраиваемых в эти мембраны нанопор. Такое устройство («Наноридер»?) должно отслеживать изменения электропроводности (и/или импеданса) отдельных лунок при формировании на них БЛМ, и регистрировать протекающие через одиночные ионные каналы пикоамперные токи.
Скомпоновать подключаемый к компьютеру по USB 2.0 ридер можно из стандартных элементов: FPGA (100…200$), усилители тока (MAX9923FEUB – 200…300 руб.), АЦП (1…2 тыс. руб.) и т.п… Разработать придётся только плату с нестандартной контактной площадкой (10×13) типа LGA (Land Grid Array) для стыковки с ячейкой от Flongle. Или с её упрощённым отечественным аналогом, содержащим меньшее количество (16…32) сенсорных лунок.
Снижение расчётной производительности ячеек в 4…8 раз (до 10…20 Mb) не критично для решения многих задач (определения патогенов, HLA-типирования, установления отцовства, идентификации личности и т.д.), зато позволяет собрать нанопоровый секвенатор на обычных усилителях пикоамперных токов. И обойтись без применения специальных 512-канальных чипов, в разработку которых оксфордцы вложили десятки миллионов долларов. Правда, каждый многоканальный наноридер должен содержать больше десятка усилителей тока + АЦП, но всё равно он может стоить в несколько раз меньше фирменного сочетания MinION + Flongle (> 200 тыс. руб.). Что касается низкой производительности наноридера, то для российских пользователей, не имеющих приличных компьютеров (медиков, биологов, биохакеров и т.п.), она может оказаться даже полезной.
Килоридер
Разработанные оксфордцами 512-канальные усилители пикоамперных токов содержатся в каждой одноразовой ячейке к MinION. Отработанные ячейки можно выбрасывать, но лучше использовать содержащиеся в них чипы для производства аналогов Flongle, отличающихся повышенной производительностью. Если эти чипы оснастить поверхностными контактами, то они смогут работать с контактными ячейками, содержащими по 2048 (512х4) сенсорных лунок.
Разработать ячейки с такими LGA будет не просто, но нужно учитывать, что требования к контактам здесь менее строгие, чем у процессоров и материнских плат, у которых один плохой контакт способен вывести из строя всю систему. Для секвенатора неработоспособность даже половины контактов ячейки может считаться приемлемой. Оставшейся половины достаточно для обеспечения производительности на уровне 5…10 Gb.
Логичным развитием этой идеи будет объединение в одном приборе нескольких подобных ридеров. Это позволит получить аналог секвенатора GridION X5, рассчитанный на одновременную работу с пятью (и более) многоразовыми ячейками отечественного производства. Такой секвенатор может быть востребован во многих клинико-диагностических лабораториях.
Одноразовые ячейки секвенаторов PromethION содержат на чипах по 9000 сенсорных лунок. А сами чипы являются 3000-канальными усилителями пикоамперных токов. Поток выдаваемой ими с 24 (у PromethION 24) или с 48 (у PromethION 48) ячеек информации настолько велик, что в «сыром» виде его невозможно передать на обычный внешний компьютер. Поэтому секвенаторы данного типа обязательно комплектуются собственным суперкомпьютером. Но если секвенатор будет работать только с одной ячейкой, то его можно будет подключать и к обычному игровому ноутбуку с портом Thunderbolt 3.0.
Переделка бесплатных (выбрасываемых) чипов от ONT для работы с контактными ячейками не является неразрешимой проблемой. Но построенные на использовании таких чипов секвенаторы смогут работать только с программным обеспечением от ONT. И усилия, которые придётся потратить на переделку этих программ, могут свести на нет преимущества от использования готовых чипов. А разрабатывать подобные чипы с нуля слишком накладно.
Мегаридер
В этом году должно начаться бета-тестирование нанопорового секвенатора компании AXBIO (США). В нём используются чипы с миллионом каналов усиления тока, производимые в Японии израильской компанией Tower Semiconductor Ltd… Расходными реагентами и продажей этих секвенаторов будет заниматься китайский филиал компании AXBIO.
На территории США и Евросоюза нанопоровому секвенированию посвящены больше 7 тысяч патентов, что создаёт непредсказуемые финансовые риски для местных компаний, пытающихся заниматься подобными технологиями. По-видимому, это является основной причиной столь высокой интернационализации данной разработки. И позволяет российским компаниям и лабораториям без каких-либо ограничений участвовать в апробации и совершенствовании технологии AXBIO, а также производить (или собирать) такие секвенаторы на своей территории.
Терабайты сырых данных, получаемых нанопоровым секвенатором с мегапиксельными чипами (мегаридером), желательно фильтровать. И передавать на компьютер только самые длинные и качественные риды. Это позволит не только повысить качество секвенирования, но и понизить требования к компьютеру, что тоже немаловажно при массовом производстве и широком применении геномных секвенаторов. Кроме того, избыточная производительность мегаридеров способна уменьшить продолжительность секвенирования генома человека с 2…3 суток (у ONT) до нескольких часов.
Сумма технологий
Успеху компании ONT способствовала организация параллельной конвейерной оптимизации пяти основных элементов технологии нанопорового секвенирования – мембраны, нанопоры, “мотора” (хеликазы), условий секвенирования и алгоритмов расшифровки считываемых сигналов.
Гарантийный срок хранения ячеек для нанопорового секвенирования зависит в основном от стабильности бислойной липидной мембраны. Сейчас он составляет 6 недель, хотя обычно такие мембраны разрушаются за несколько дней. Для увеличения срока их хранения используют гидрофобные полимерные добавки, поверхностно-активные блок-сополимеры, холестерин, антиоксиданты, поперечную сшивку жирных кислот и т.п., причём подобные модификации могут мешать формированию ионных каналов. Поэтому добиться стабильности БЛМ очень непросто.
Кардинально решить данную проблему позволяет формирование мембран в рабочих ячейках секвенатора и введение в них нанопор непосредственно перед использованием. Самостоятельная подготовка ячеек к работе обеспечит возможность их регенерации и многократного использования. Что касается сроков хранения, то для сухих ячеек он практически неограничен, а необходимые для их активации и регенерации реагенты могут храниться месяцами.
Самое узкое место в технологии нанопопрового секвенирования – это одновременно и самое узкое место нанопоры, от которого зависит качество считываемой информации. Поэтому одной из главных задач компании ONT был поиск мембранного белка, позволяющего получать результаты приемлемого качества.
Первым таким белком стал CsgG – белок наружной мембраны, встречающийся у многих грамотрицательных бактерий. Девять его субъединиц образуют в мембране ионный канал с широкими входным и выходным вестибюлями, и одним узким местом. Но получить достаточно качественные нанопоры (R9, R9.4.1, R9.5.1) удалось только после перебора и анализа сотен модифицированных вариантов CsgG. Этим летом в продаже должны появиться ячейки с порами следующего поколения (R10 или R10b), отличающимися повышенной точностью чтения гомополимерных повторов.
https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenary
Обязательной составляющей технологии нанопорового секвенирования компании ONT является хеликаза – молекулярный мотор, расплетающий двунитевую ДНК и тормозящий продвижение однонитевой ДНК через нанопору. Максимальная скорость расплетания ДНК таким мотором сейчас достигает 450 пар нуклеотидов в секунду, хотя быстродействие электронных компонентов MinION позволяет повысить её до 1000 нуклеотидов в секунду. Теоретически ускорение работы хеликазы способно удвоить производительность MinION, но на практике это может привести к ухудшению качества секвенирования. Поэтому более быстрые и процессивные хеликазы вряд ли улучшат производительность нанопоровых секвенаторов типа MinION и PromethION.
Качество секвенирования зависит от множества условий — величины подаваемого на мембрану напряжения, электропроводности и ионного состава реакционной смеси, количества и характера закупоривающих поры примесей, возможности очистки закупоренных пор изменением полярности потенциала, структуры используемых адапторов и т.д, и т.п… Поэтому нанопоровое секвенирование требует тщательной оптимизации всех его параметров и составов рабочих растворов (Run Conditions), способных отрицательно повлиять на качество оцифровки нуклеотидных последовательностей. Например, недавно было показано, что уменьшение концентрации расщепляемой хеликазой АТФ постепенно снижает точность результатов секвенирования, и теперь оксфордцы пытаются устранить эту проблему введением в реакционную смесь системы регенерации АТФ.
Пятым элементом технологии нанопорового секвенирования является искусственный интеллект, построенный на рекуррентных нейронных сетях (RNN) и на применении некоторых специальных алгоритмов и программ, улучшающих распознавание гомогенных повторов (Flip-flop, Medaka). В июле должен появиться очередной релиз программ Guppi и MinKNOW, в котором оксфордцы обещают добавить возможность определения метилированных оснований (5mC и 6mA). Это немаловажно не только для эпигеномных исследований, но и для улучшения распознавания обычных оснований.
Большие объёмы считываемой нанопоровыми секвенаторами информации и сложность её обработки предъявляют повышенные требования к аппаратной части таких программно-аппаратных комплексов. Поэтому далеко не каждый компьютер подходит для подключения MinION, в GridION и в PromethION ставятся графические ускорители последнего поколения, а одним из первых покупателей крупной партии модулей Jetson AGX Xavier (NVIDIA), предназначенных для устройств с искусственным интеллектом, стала компания Oxford Nanopore Technologies.
Ещё недавно нанопоровая технология считалась не более чем полезным дополнением к более точным технологиям флуоресцентного и полупроводникового секвенирования. Но постепенное повышение точности чтения ДНК, сочетающееся с большой длиной читаемых последовательностей, позволили ей если не опередить всех конкурентов, то по крайней мере определить главный вектор развития технологий геномного секвенирования.
На освоение всех элементов технологии нанопорового секвенирования может понадобиться довольно много времени, но это не самая большая проблема. Основной проблемой является отсутствие в России целевого финансирования таких комплексных разработок. Правда, в недавно утвержденной Федеральной научно-технической программе развития генетических технологий на 2019–2027 годы (раздел «Направления реализации программы») сказано, что в краткосрочной перспективе (3…6 лет) будет разработан прототип прибора для высокопроизводительного геномного секвенирования. Но найти эту единственную строчку на 30 страницах текста не так-то просто. Проще договориться с китайцами о закупке секвенаторов AXBIO.
Ещё проще — найти умельцев, которые смогут «на коленке» собрать простейший наноридер. И потом ходить с протянутой рукой в поисках инвесторов, которые согласятся профинансировать разработку отечественной технологии нанопорового секвенирования.
Секвенаторы ДНК 3-го поколения, нанопоровые
Секвенатор нанопоровый MinION с комплектом принадлежностей, 512 каналов
Секвенатор нанопоровый MinION
Это портативное устройство для прямого секвенирования ДНК и РНК в реальном времени.
В основе прибора ячейка с 512 нанопоровыми каналами (максимальная ёмкость), каждый из которых предназначен для анализа отдельной молекулы нуклеиновой кислоты. В сумме прибор позволяет получить до 30 Гб информации о последовательности ДНК. Длина прочтения, фактически, ограничена только длиной фрагмента нуклеиновой кислоты и составляет сотни тысяч нуклеотидов.
MinION подключается к USB-порту 3.0 ПК или ноутбука для вывода и анализа информации, полученной в процессе секвенирования. Никакое дополнительное компьютерное или лабораторное оборудование не требуется.
Секвенатор нанопоровый Mk1C Capex, 512 каналов, с портативным ПК
Mk1C Capex – портативный высокопроизводительный нанопоровый секвенатор производства Oxford Nanopore Technologies, объединяющий в себе секвенирующий блок и управляющую станцию с дисплеем, предназначенный для запуска одной стандартной проточной ячейки R9 или R10. Этот прибор является обновленной версией секвенатора MinION.
В основе прибора ячейка с 512 нанопоровыми каналами (максимальная ёмкость), каждый из которых предназначен для анализа отдельной молекулы нуклеиновой кислоты. В сумме прибор позволяет получить до 45 Гб информации о последовательности ДНК за один запуск. Длина прочтения, фактически, ограничена только длиной фрагмента нуклеиновой кислоты и составляет сотни тысяч нуклеотидов.
Mk1C Capex включает управляющую станцию со следующими характеристиками:
Для работы прибора не требуется постоянное интернет-подключение, однако оно требуется для обновления программного обеспечения. Данные с прибора можно выгрузить на внешний носитель через порт USB (также есть порт для MicroSD карты памяти).
Комплект поставки: секвенатор Mk1C Capex со встроенным ПК.
Секвенатор нанопоровый GridION X5 – Capex, 5 x 512 каналов
Характеристки секвенатора нанопорового GridION Mk1
GridION X5 – Capex, в отличие от MinION, состоит из пяти проточных ячеек с нанопоровыми каналами и обладает теми же достоинствами, что и MinION – простая пробоподготовка и быстрое секвенирование молекул нуклеиновых кислот любой длины.
Пять ячеек позволяют проводить пять параллельных независимых экспериментов, что удобно для лабораторий с большим объёмом исследований. Общий объём информации о последовательности ДНК, полученный с помощью GridION Х5, может быть до 150 Гб (объём встроенного SSD-диска – 4 Тб).
В отличие от MinION, в корпус GridION уже встроены все компоненты, необходимые для управления секвенированием и обработки данных:
Комплект поставки: секвенатор GridION X5 – Capex со встроенным ПК.
Секвенатор нанопоровый PromethION, 24 x 3000 каналов
PromethION 24 — прибор для высокопроизводительного секвенирования, включающий 24 независимые ячейки с 3000 каналов каждая. Пользователь может задействовать любое количество этих ячеек, в каждой из которых будет проводиться отдельный эксперимент. Прибор состоит из секвенирующего модуля на 24 ячейки и станции для сбора, хранения и обработки данных.
Секвенирующий модуль PromethION 24
Станция для сбора, хранения и обработки данных PromethION 24
Комплект поставки: секвенатор PromethION 24 со станцией для сбора, хранения и обработки данных.
Секвенатор нанопоровый PromethION, 48 х 3000 каналов
PromethION 48 — прибор для высокопроизводительного секвенирования, включающий 48 независимых ячеек с 3000 каналов каждая. Пользователь может задействовать любое количество этих ячеек, в каждой из которых будет проводиться отдельный эксперимент. Прибор состоит из секвенирующего модуля на 48 ячеек и станции для сбора, хранения и обработки данных.
Секвенирующий модуль PromethION 48
Станция для сбора, хранения и обработки данных PromethION 48
Комплект поставки: секвенатор PromethION 48 со станцией для сбора, хранения и обработки данных.
Oxford Nanopore Technologies — это нанопоровые секвенаторы третьего поколения MinION, GridION и PromethION.
MinION — карманный секвенатор, одна проточная ячейка, до 20 Гб данных.
GridION — настольный секвенатор, 5 проточных ячеек — 2560 каналов с нанопорами.
PromethION — самый высокопроизводительный секвенатор, существующий на сегодняшний день, 48 проточных ячеек — 144 000 каналов с нанопорами.
MinIT (доступен с 2019 г.) — карманный компьютер для работы с секвенатором MinION.
VolTRAX — портативный прибор для автоматической подготовки библиотек.
Flongle — адаптер для MinION и GridION, для работы с одноразовыми ячейками.
SmidgION — секвенатор для смартфона (находится в разработке).