На чем основано определение глюкозы в биологических жидкостях
Современные методы определения глюкозы
Герасименко В.А., к.м.н., Куриляк О.А., к.б.н.
Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»
Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.
В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.
Методы определения глюкозы в сыворотке крови
— фотометрический по конечной точке
— отражательная фотометрия – сухая химия
Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.
Глюкозооксидазный метод
Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:
Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).
На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.
Рисунок 1. Спектр рабочего раствора
Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)
Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.
Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.
Рисунок 3. Измерительная ячейка
В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.
Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.
В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.
Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».
Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.
Рисунок 4. Конструкция тест-полоски
В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.
В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”. Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы One Touch откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.
С момента появления на рынке приборов One Touch прошло большое количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы. Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром РАМН по заказу Российской Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови. Результаты, полученные на One Touch, сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, США), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент корреляции результатов составил 0,98641. Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре One Touch не превысил 2,5%.
Рис. 5. Корреляционная зависимость показаний “One Touch” и «Спектрум-2» (коэффициент корреляции 0,98641)
В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: «приборы One Touch обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами “Скорой помощи”, поскольку эти приборы не только надежны, но и быстро дают результаты».
Гексокиназный метод
Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.
Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать:
Т.о., задача КДЛ обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.
На чем основано определение глюкозы в биологических жидкостях
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ, Москва
Институт диабета Эндокринологического научного центра, Москва
Технологии непрерывного мониторирования глюкозы: успехи и перспективы
Журнал: Проблемы эндокринологии. 2015;61(4): 54-72
Тарасов Ю. В., Филиппов Ю. И., Борисова Е. К., Федорова Е. А., Майоров А. Ю., Шестакова М. В. Технологии непрерывного мониторирования глюкозы: успехи и перспективы. Проблемы эндокринологии. 2015;61(4):54-72.
Tarasov Yu V, Filippov Iu I, Borisova E K, Fedorova E A, Maĭorov A Iu, Shestakova M V. Continuous glucose monitoring technologies: state of the art and future perspectives in view of artificial pancreas. Problemy Endokrinologii. 2015;61(4):54-72.
https://doi.org/10.14341/probl201561454-72
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
Непрерывное мониторирование гликемии (НМГ) — относительно новая и активно развивающаяся технология оптимизации гликемического контроля у пациентов с сахарным диабетом. Доказана эффективность применения НМГ для улучшения показателей гликемии во многих клинических ситуациях (бессимптомные гипогликемии, высокая вариабельность гликемии и др.). В перспективе НМГ рассматривают как обязательный компонент «искусственной поджелудочной железы» — инсулиновой помпы с замкнутым контуром управления инфузией инсулина в зависимости от концентрации глюкозы в крови. Однако из-за существенных ограничений и недостаточной высокой точности использование показателей НМГ в качестве источника данных в замкнутом контуре управления инсулиновой помпой невозможно. Дальнейшее развитие технологий НМГ, очевидно, будет направлено на решение трех основных задач: увеличения срока службы сенсоров для детекции глюкозы, повышения точности результатов измерений и удобства использования для пациентов. В статье рассмотрены основные технологические решения современных приборов для НМГ и перспективные направления дальнейших разработок в данной области, их потенциальные преимущества и недостатки, в том числе в свете возможности их дальнейшей интеграции в «искусственную поджелудочную железу».
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ, Москва
Институт диабета Эндокринологического научного центра, Москва
Непрерывное мониторирование гликемии (НМГ) — метод регистрации изменений концентрации глюкозы в крови, при котором результаты фиксируются с очень небольшими промежутками (не более 5 мин) на протяжении длительного времени (более суток).
Согласно результатам DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) и других крупных исследований, интенсифицированная инсулинотерапия, включающая регулярный частый самоконтроль гликемии (СКГК), позволяет снизить выраженность осложнений сахарного диабета (СД) и предотвратить их формирование [1]. В связи с этим международные и отечественные рекомендации постулируют частый регулярный самоконтроль как неотъемлемую часть лечения СД [2, 3].
Наиболее распространенный способ самоконтроля гликемии среди людей с СД состоит в проведении экспресс-анализов образцов крови (как правило, капиллярной, взятой из пальца) с применением тест-полосок и персональных анализаторов (глюкометров) [4]. У этого способа есть объективные недостатки и ограничения. НМГ имеет объективные преимущества перед традиционным СКГК [5], в том числе:
— позволяет получать информацию о концентрации глюкозы в крови в непрерывном режиме;
— дает представление о тенденции изменений гликемии, а не только о ее фактическом уровне;
— позволяет предупреждать пользователя о выходе гликемии из целевой зоны (как в момент выхода, так и заблаговременно – учитывая динамику показателей);
— позволяет оценить истинную картину изменений гликемии в течение больших промежутков времени, а не предположительную, составленную на основе единичных измерений.
Более того, НМГ считают неотъемлемым компонентом «искусственной поджелудочной железы» — инсулиновой помпы, самостоятельно управляющей введением инсулина с учетом изменений гликемии в режиме реального времени по принципу «замкнутого контура». В целом, НМГ является одним из наиболее перспективных направлений развития технологий лечения СД [6]. В то же время у применяющихся сегодня в клинической практике приборов имеется множество недостатков, которые ограничивают использование НМГ. Наиболее существенные недостатки касаются трех аспектов — точности результатов, удобства ношения сенсора глюкозы на теле пациента и срока службы сенсора.
Технологии непрерывного мониторирования гликемии
С клинической точки зрения, применяющиеся устройства для НМГ принято делить на два типа: в «слепом» режиме (или «профессиональное» мониторирование) и в режиме «реального времени» (иногда его называют «пользовательским» мониторированием) [5]. Устройства для НМГ разделяют также на инвазивные, малоинвазивные и неинвазивные (рис. 1), а также (в зависимости от метода определения концентрации глюкозы) — на электрохимические, оптические и пьезоэлектрические.
Рис. 1. Общая классификация технологий НМГ.
Инвазивность устройства для НМГ определяется способом размещения сенсора глюкозы, а также способом связи с блоком электронной обработки. Способ размещения сенсора в свою очередь определяется реализованными в устройстве механизмами преобразования сигнала и определения глюкозы.
Инвазивные
Инвазивные устройства имеют полностью имплантируемые (подкожно или внутривенно) сенсоры с модулем беспроводного подключения к внешнему контроллеру. Принцип действия большинства имплантируемых сенсоров основывается на ферментативном окислении глюкозы с последующим электрохимическим или оптическим анализом продуктов реакции [7, 8]; реже используется принцип микродиализа (см. ниже). Инвазивные сенсоры могут быть полностью имплантируемыми или трансдермальными (наиболее часто встречающийся вариант) [9, 10].
Малоинвазивные
Малоинвазивные сенсоры глюкозы обычно размещаются на поверхности тела совместно с блоками обработки результатов и вывода информации. Сенсоры в данном случае либо не проникают в кожу вообще, либо их проникновение незначительно по времени и по глубине (компоненты системы не проникают за пределы эпидермиса). Предложено несколько сенсоров для НМГ, которые можно отнести к малоинвазивным, в том числе следующие.
1. Ионофорез. Через кожу сенсор пропускает слабый электрический ток (в конструкцию сенсора входят два близко расположенных друг к другу электрода, между которыми создается напряжение). Электрический ток провоцирует направленное движение поляризованных молекул (а также под действием индукции и других межмолекулярных взаимодействий – и незаряженных молекул) по кожным порам через дерму. Это стимулирует выведение на поверхности кожи микрокапель интерстициальной жидкости (ИСЖ), в которой и происходит определение концентрации глюкозы. Как правило, детекция глюкозы осуществляется путем электрохимического окисления глюкозы на поверхности сенсора [11].
2. Сонофорез. Низкочастотный ультразвук способен расширять и сжимать газообразные включения в роговом слое коже, увеличивая таким образом его проницаемость и стимулируя выход ИСЖ на поверхность. Как и в предыдущем случае, детекция глюкозы происходит в этой ИСЖ путем электрохимического окисления или спектроскопического анализа [12].
3. Вакуумизация. Локальное краткосрочноое воздействие вакуума стимулирует пропотевание ИСЖ на поверхность кожи. Детекция глюкозы опять-таки осуществляется путем электрохимического окисления [13].
4. Микропористая лазерная аблация или лазерная десорбция. Лазерное излучение малой мощности испаряет ИСЖ из микропор рогового слоя кожи; ИСЖ конденсируется (с помощью небольшого вакуума) и анализируется (электрохимическое окисление) [14].
5. Микропроколы. Технология основана на применении кремниевых микроигл (диаметр x ), катализирующую окисление глюкозы до глюконолактона. В ходе реакции кофермент (флавинаденинмононуклеотид) переходит в восстановленную форму (флавинадениндинуклеотид) (см. рис. 2: реакция 1). В зависимости от дальнейшей переконвертации фермента обратно в окисленную форму сенсоры относятся к одному из трех поколений.
Рис. 2. Различные способы детекции глюкозы электрохимическим методом [17]. а — биосенсоры I поколения, задействующие кислород окружающей среды; б — биосенсоры II поколения с применением искусственных медиаторов электронного транспорта; в — биосенсоры III поколения, реализующие прямой перенос электронов между электродом и GOx; г — прямое электроокисление глюкозы.
1. В сенсорах первого поколения восстановленная форма фермента окисляется кислородом внешней среды. В результате образуется перекись водорода Н 2 О 2 (см. рис. 2, а: реакция 2). Концентрация глюкозы рассчитывается, исходя из напряжения, зафиксированного либо при электрохимическом окислении образовавшейся Н 2 О 2 (см. рис. 2, а: реакция 3), либо при электрохимическом восстановлении О 2 на рабочем электроде (см. рис. 2, а: реакция 4).
2. В биосенсорах второго поколения окисление восстановленной формы фермента осуществляется медиаторами электронного транспорта (см. рис. 2, б: реакция 5), конкурирующими с кислородом (естественным субстратом реакции). Концентрация глюкозы может быть соотнесена с силой амперометрического сигнала, зафиксированного при электрохимическом окислении восстановленного медиатора (см. рис. 2, б: реакция 6) [16].
3. В биосенсорах третьего поколения окислительно-восстановительный кофермент ковалентно или электрохимически связан с рабочим электродом, что способствует протеканию обратного восстановления (или обратного окисления) путем прямого переноса электронов с рабочего электрода (или на него). Зарегистрированный при этом амперометрический сигнал может быть соотнесен с концентрацией глюкозы (см. рис. 2, в: реакция 7) [7].
Помимо оксидаз, при ферментативной детекции глюкозы применяются глюкозодегидрогеназы [6] и хинопротеин глюкозодегидрогеназы [18]. Для окисления восстановленных форм этих ферментов используются такие типичные для биологических систем медиаторы электронного транспорта, как никотинамидадениндинуклеотид (NAD + ) и хиноны.
Безферментный метод представляет собой прямое электрокаталитическое окисление глюкозы до глюконовой кислоты на наноструктурных электродах, обладающих большой поверхностью и электрокаталитической активностью (платиновые «массивы нанодендритов»; сетки нанонитей из платиново-свинцового сплава; наночастицы золота и композитные наноструктуры, содержащие платину, золото, свинец, паладий или родий) (см. рис. 2, в: реакция 8) [19, 20].
Оптический
Детекция глюкозы, основанная на оптических принципах, включает два основных подхода:
1. Применение флуорофоров.
2. Непосредственное оптическое определение.
Применение флуорофоров основано на принципах стереохимического сродства, согласно которым глюкоза и флуорофор конкурируют за взаимодействие с сайт-специфическим для обоих лигандов рецептором [13, 21]. В качестве рецепторной молекулы может применяться, к примеру, конкавалин, А (Кон А), что обусловлено наличием у него четырех сайтов связывания глюкозы. Оценка активности связывания в конкурентных условиях может быть проведена при введении других лигандов, таких как меченный флюоресцеином декстран, α-метилманнозид и гликированный белок [22, 23]. Измерение концентрации глюкозы обеспечивается различными спектроскопическими методами, в том числе приведенными ниже.
1. Присоединение меченного флюоресцеином декстрана к Кон, А вызывает перенос электрического заряда молекулы с последующим падением интенсивности флюоресценции связанного лиганда. Сродство Кон, А к глюкозе выше, чем к декстрану. Поэтому в присутствии глюкозы возрастает количество свободного (несвязанного) декстрана, что проявляется увеличением интенсивности флюоресцентного излучения (рис. 3, а). Концентрация глюкозы прямо пропорциональна интенсивности флюоресценции меченого декстрана.
Рис. 3. Оптическая детекция глюкозы (адаптировано из [17]). а — снижение интенсивности флюоресценции в результате аффинного связывания; б — снижение интенсивности ФРПЭ-индуцированной флюоресценции.
2. В результате Ферстеровского резонансного переноса энергии (ФРПЭ) между меченным аллофикоцианином Кон, А (донор) и меченным флюоресцеином декстраном (акцептор), который протекает при их сближении на расстояния атомарного масштаба (Ферстеровского радиуса), возникает флюоресцентное излучение [13, 22]. Любая имеющаяся молекула глюкозы присоединяется к Кон А, тем самым увеличивая дистанцию между донором и акцептором данного взаимодействия (с превышением Ферстеровского радиуса), что приводит к падению интенсивности ФРПЭ-индуцированного флюоресцентного излучения (см. рис. 3, б). Таким образом, о концентрации глюкозы можно судить по изменениям интенсивности испускания меченного флюоресцеином декстрана, вызванных ФРПЭ [24, 25].
3. ФРПЭ между молекулами донора и молекулами акцептора сопровождается сокращением времени жизни донора. Кроме того, присутствие глюкозы снижает вероятность осуществления ФРПЭ (см. рис. 3, б). Отсюда следует, что возрастание времени жизни донора может наблюдаться на фоне увеличения концентрации глюкозы. Таким образом, содержание глюкозы может быть определено путем регистрации времени жизни молекулы донора, расположенной в непосредственной близости от молекулы акцептора [13, 22].
4. Можно также регистрировать интенсивность флюоресценции тканей, если в качестве флуорофора используется сама глюкоза. При облучении тканей светом с длиной волны 308 нм молекулы глюкозы переходят в возбужденное состояние и испускают флюоресцентное излучение, которое может быть зафиксировано на 340, 380 или 400 нм. Таким образом, определение концентрации глюкозы может осуществляться с помощью непосредственного облучения тканей волнами длиной 308 нм с последующей регистрацией интенсивности излучения на 380 нм (данной длине волны соответствует максимальная интенсивность испускания глюкозой флюоресцентного излучения).
5. При спектроскопическом анализе секрета слезных желез применяются включенные в полимерный носитель синтетические производные бороновой кислоты, которые обратимо связываются с глюкозой. К этим молекулам присоединяют флюоресцентные группы, что обусловливает возможность их спектроскопического определения. При взаимодействии с глюкозой группа бороновой кислоты, имеющая sp2-гибридизованную тригональную конфигурацию, принимает более насыщенную электронами sp3-гибридизованную тетраэдрическую форму, что вызывает изменение эмиссионного спектра флюоресцентного фрагмента [26].
При непосредственном оптическом определении глюкозы применяется свет переменной частоты и регистрируются изменения характеристик абсорбции, отражения или преломления (рассеивания) для тканей, содержащих различные концентрации глюкозы [13, 21]. В частности, установлено, что световые волны БИК-диапазона проникают через роговой слой эпидермиса с минимальным поглощением в тканях. Более того, светопоглощающие свойства воды таковы, что в БИК-области имеется интервал (0,8—1,4 мкм), в пределах которого отсутствует абсорбция тканями, что обусловливает глубокое проникновение такого света в эпидермис и подкожную жировую клетчатку независимо от пигментации кожи. Благодаря этому свет БИК-диапазона рассматривается как потенциальное средство регистрации изменений оптических свойств, происходящих под влиянием глюкозы в подкожной жировой клетчатке. К примеру, колебания концентрации глюкозы влекут за собой изменения электрической прочности, поляризуемости и диэлектрической проницаемости подкожной жировой клетчатки, что позволяет регистрировать сдвиги абсорбции, отражения и преломления БИК-излучения соответственно. Ниже приводится ряд методов оптического анализа, основанных на регистрации подобных сдвигов и не требующих введения флуорофоров.
1. Оптическая когерентная томография позволяет измерить концентрацию глюкозы путем определения интенсивности отраженного/рассеянного и пропускаемого света сразу после взаимодействия подкожной жировой клетчатки с глюкозой в определенной концентрации [27].
2. Поляриметрический анализ основывается на способности глюкозы к вращению плоскополяризованных световых волн и возможности последующей количественной оценки ее концентрации, опираясь на величину оптического вращения [28].
3. Тепловая И.К. спектроскопия основана на локальном нагревании ткани при действии света, что приводит к изменениям микроциркуляции, в свою очередь влияющей на показатель оптического преломления ткани. Степень изменения оптического преломления в данном случае непосредственно зависит от концентрации в ткани глюкозы [29].
4. Применение фотоакустической спектроскопии основывается на адсорбции света, проявляющейся локальным нагревом тканей с последующим распространением ультразвуковых волн в результате объемного расширения. Детекция глюкозы с помощью фотоакустической спектроскопии подразумевает облучение тканей светом БИК-спектра с дальнейшей регистрацией скорости распространения ультразвуковых волн. Последняя зависит от удельной теплоемкости облучаемой ткани, которая в свою очередь определяется концентрацией глюкозы [30, 31].
5. В основе Рамановской спектроскопии лежит явление неупругого рассеяния фотонов. При взаимодействии глюкозы с монохроматическим светом возникает обусловленный эффектом Рамана сдвиг энергетического состояния фотонов, пропорциональный колебательной или вращательной энергии молекул глюкозы [30, 32]. Рамановский спектр характеризует специфическую для глюкозы внутримолекулярную (колебательную или вращательную) подвижность связей, поэтому он может использоваться в качестве селективного индикатора ее концентрации. Так, с помощью Рамановской спектроскопии можно дифференцировать галактозу и глюкозу — два эпимера с одинаковым химическим составом, но с разным положением одного атома [21].
6. В сенсорах глюкозы на базе фотонных кристаллов использован эффект смещения длины волны света, подвергшегося дифракции на кристаллическом коллоидном массиве с гидрогелевой основой. Сенсор состоит из полиакриламид-полиэтиленгликолевой сетки с включенными в нее кристаллическим коллоидным массивом и распознающим элементом (например, производным бороновой кислоты), который специфически связывается с глюкозой. В результате взаимодействия глюкозы с распознающим элементом формируются поперечные связи (например, бис-бедентатные), что сокращает объем гидрогеля. Его сжатие инициирует пропорциональное количеству связанной глюкозы смещение дифракции от кристаллического коллоидного массива в коротковолновую часть спектра. Изменения цвета могут быть восприняты визуально (без использования специального оборудования) в пределах видимой части спектра (от красного до фиолетового), что отвечает физиологически значимому диапазону концентраций глюкозы [33]. Поскольку данный механизм реализуется посредством химически индуцированного набухания, проявляющегося механической деформацией и изменением оптических свойств фотонного кристалла, такая технология может быть отнесена к хемо-механо-оптическим преобразованиям.
Другие подходы
Помимо электрохимических и оптических подходов, известна также детекция глюкозы, основанная на электрических или электромагнитных преобразованиях. Повышение концентрации глюкозы вызывает снижение концентрации натрия и увеличение концентрации калия в плазме, что изменяет ее диэлектрические свойства и электропроводность. Это позволяет определять глюкозу методом импедансной спектроскопии: путем пропускания переменного тока через ткани для регистрации изменений электропроводности плазмы крови, обусловленных изменениями концентрации глюкозы [34].
С помощью электромагнитной спектроскопии можно определить концентрацию глюкозы, измеряя силу электромагнитного взаимодействия двух индукторов, которая зависит от диэлектрической проницаемости среды, а последняя в свою очередь — от локальной концентрации глюкозы [35].
Факторы, определяющие дальнейшее развитие технологий нмг
В данном разделе каждая из технологий НМГ рассматривается с позиции проблем и недостатков, препятствующих дальнейшему развитию и более широкому использованию НМГ в клинической практике. Также обсуждаются возможные подходы для преодоления данных сложностей. Изложение материала соответствует содержанию табл. 1 и 2.
Таблица 1. Сравнение различных технологий НМГ по их инвазивности
Таблица 2. Сравнение различных технологий НМГ по типу передачи сигнала
Таблица 3. Допустимые отклонения точности устройств НМГ (ISO 15197:2013) Примечание. *— количество образцов, погрешность измерения в которых не должна превышать установленный лимит.
Точность показаний
Как и для любого аналитического медицинского оборудования, из всех требований, предъявляемых к устройству НМГ, наиболее важным является точность показаний. И это обусловлено не только перспективами перехода от отдельно стоящего прибора, непрерывно проводящего измерения, к устроенной по принципу замкнутого контура искусственной поджелудочной железе, но и необходимостью подтверждения достоверности показаний для врачей и пациентов.
В соответствии с критериями, разработанными Международной организацией по стандартизации (ISO 15197:2013), сенсор считается точным, если при определении концентрации глюкозы в крови во время гипогликемического эпизода, когда фактическая концентрация глюкозы 4,2 ммоль/л максимально допустимая погрешность составляет 15% [36].
Однако данные стандарты распространяются исключительно на глюкометры, метрологические стандарты точности для приборов НМГ не утверждены [37]. В то же время разработан нормативный документ РОСТ05-А (подготовленный Институтом клинических и лабораторных стандартов совместно с Диабетическим технологическим обществом), в котором собраны некоторые контрольные показатели точности измерений, а также нормативы, утвержденные для НМГ глюкозы в межтканевой жидкости [38].
Большинство методов оценки точности НМГ состоит в сопоставлении показателей прибора НМГ с соответствующими референсными значениями при помощи методов линейного регрессионного анализа, анализа погрешностей с использованием зон различной клинической достоверности, остаточной суммы квадратов отклонений и среднего абсолютного отклонения [13, 39]. В качестве ориентира для оценки точности сенсора предпочитают применять анализ погрешностей с использованием зон различной клинической достоверности по Кларку, который выражает относительные различия измерений НМГ и клинического анализатора (последние принимаются за «фактическую» гликемию) [40]. Типичная решетка Кларка представляет собой график с нанесением «фактических» значений гликемии по оси х, а показателей тестируемого сенсора – по оси y (рис. 4, а). В случае идеальной корреляции между двумя группами измерений все наносимые на график точки будут лежать на прямой линии, выходящей из начала координат под углом 45°. В случае неидеальной корреляции точки будут разбросаны от линии 45° тем дальше, чем больше ошибка, что, несомненно, следует учитывать при интерпретации результатов. Все поле возможных значений разделено на зоны, расположенные по обе стороны линии 45°, которые отражают не столько математическую разность между полученным и референсным значением, сколько клиническую значимость ошибки [40]:
Рис. 4. Вид графиков определения клинической значимости погрешностей измерения концентрации глюкозы с нанесенными сеткой Кларка (а) и решеткой Паркса (б).
— Зона А: принятые на основе этих показателей клинические решения приведут и идентичным результатам с решениями, принятыми на основе значений, полученных референсным методом.
— Зона В: показатели не приведут к ошибке в назначении лечения или ошибка будет незначительной и не повлияет на состояние пациента.
— Зона C: использование полученного показателя приведет к серьезной ошибке, которая, скорее всего, ухудшит состояние пациента.
— Зона D: показатель приведет к очень серьезной ошибке, которая сильно ухудшит состояние пациента.
— Зона E: использование такого показателя приведет к фатальной ошибке, которая может оказаться опасной для жизни пациента.
При количественной оценке частоты попадания экспериментальных точек в зоны, А и В обычно учитываются два параметра: линейный коэффициент корреляции между «фактическим» значением гликемии и показателями тестируемого сенсора; доля принадлежащих зонам, А и В экспериментальных точек, выраженная в процентном отношении.
Основным недостатком решетки Кларка является непоследовательность перехода от одной зоны к другой. Это означает, что минимальное изменение зафиксированной сенсором концентрации глюкозы может сдвинуть результат из зоны корректных значений, А в зону критических ошибок D и наоборот. С учетом этого была разработана решетка Паркса (см. рис. 4, б), в которой соблюдена последовательность расположения зон, что предотвращает возможность ошибочного отнесения результата к несоответствующей ему зоне [41]. Тем не менее решетка Паркса строится индивидуально для каждого пациента и не обладает универсальностью, необходимой для оценки точности метода НМГ независимо от его технологии. Стоит заметить, что сведения о преимуществах и недостатках каждого из методов постоянно пересматриваются и актуализируются, и тем не менее процентные доли экспериментальных точек, расположенных в зоне А, полученные для одного и того же устройства НМГ с помощью решеток Кларка и Паркса, не совпадают. Например, точность конкретного устройства НМГ оценивалась в 98,6% на основании анализа с помощью решетки Паркса, тогда как при применении решетки Кларка был получен результат 95% [13].
Как сетка Кларка, так и решетка Паркса были изначально разработаны для оценки клинической безопасности получаемых при самоконтроле тем или иным прибором единичных значений гликемии с учетом погрешности измерений. В чистом виде для оценки клинической значимости погрешности измерений при НМГ данные методы не подходят, так как не учитывают самостоятельное значение континуума получаемых показателей. Для решения этой задачи была разработана модификация сетки Кларка [39]. Модифицированная версия учитывает временны́е характеристики НМГ, а также период задержки, имеющийся между концентрацией глюкозы в крови (референсные значения) и ИСЖ [39]. Модифицированная сетка Кларка может изменяться в зависимости от способа определения концентрации глюкозы и учитывает, что время выравнивания концентрации глюкозы в крови и ИСЖ всегда равно 7 мин (на самом деле, это время может существенно изменяться) [13].
Факторы, обусловливающие погрешности измерения
Каждый из компонентов устройства для НМГ является потенциальным источником ошибки измерения. Наиболее значимые погрешности связаны преимущественно с процессом калибровки и с точностью (в том числе с селективностью) самих сенсоров глюкозы.