На чем основано разделение белков методом аффинной хроматографии

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Изучение физико-химических свойств, химического состава и структуры возможно только при исследовании очищенного белкового препарата. Для выделения и фракционирования индивидуальных белков используются: высаливание, осаждение органическими растворителями, гельфильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.

Высаливание белковосновано на зависимости растворимости белка от свойств среды. В дистиллированной воде протеины растворяются хуже, чем в слабых растворах солей, так как низкие концентрации ионов поддерживают их гидратные оболочки. Но при высоких концентрациях соли молекулы белка теряют гидратные оболочки, агрегируют и образуется осадок. После удаления соли белки вновь переходят в раствор, сохраняя нативные свойства и конформацию.

Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используется для выделения индивидуальных белков. Чаще всего для высаливания белков используют растворы сульфата аммония разной концентрации.

Гель-фильтрацияоснована на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т.д.). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1.29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.

Рис. 1.29. Разделение белков методом гель-фильтрации

Рис. 1.30. Электрофореграмма белков сыворотки крови здорового человека

А— электрофореграмма белков сыворотки крови на бумаге;

Б— количество белков плазмы разных фракций.

Ионообменная хроматографияоснована на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белка с определенным значением рН пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым сорбентом, при этом часть белков задерживается в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбента используют ионообменные вещества: анионообменники (содержащие катионные группы) для выделения кислых белков; катионообменники (содержащие анионные группы) для выделения основных белков.

При пропускании белка через колонку прочность его связывания с ионообменником зависит от величины заряда, противоположного заряду сорбента. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферными растворами с различной концентрацией соли и рН, получая разные фракции белков.

Аффинная хроматографияоснована на специфичности связывания белка с лигандом, присоединенным к твердому носителю. В качестве лиганда используются субстраты ферментов, простетические группы холопротеинов, антигены и т.д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только комплементарный протеин (рис. 1.31, А), все остальные выходят вместе с раствором. Адсорбированный белок элюируется раствором с другим значением рН (рис. 1.31, Б). Этот метод высокоспецифичен и позволяет получать белковые препараты высокой степени очистки.

Выделение и очистка белка обычно проходят в несколько стадий с использованием различных методов. Последовательность стадий подбирается эмпирическим путем и может различаться для разных протеинов. Высокая степень очистки белков очень важна как при использовании их в качестве лекарственных препаратов (гормон инсулин и т.д.), так и при диагностике различных заболеваний по изменению белкового состава тканей, крови, слюны и др.

Набор белков в клетках различных органов взрослого человека индивидуален и поддерживается относительно постоянным на протяжении жизни. Специализированные ткани могут содержать специфические белки, например гемоглобин в эритроцитах, актин и миозин в мышцах, родопсин в сетчатке глаза, разные типы коллагена в костной и соединительной тканях. Некоторые белки содержатся во многих тканях, но в разных количествах. Отдельные изменения состава

Рис. 1.31. Разделение белков методом аффинной хроматографии

А— связывание выделяемого белка со специфическим лигандом, присоединенным к нейтральному носителю; Б— получение раствора индивидуального белка

белков тканей и крови возможны и связаны прежде всего с режимом питания, составом пищи, физической активностью человека.

Источник

СОДЕРЖАНИЕ

Принцип

Аффинная хроматография не требует знания молекулярной массы, заряда, гидрофобности или других физических свойств интересующего аналита, хотя знание его связывающих свойств полезно при разработке протокола разделения. Типы связывающих взаимодействий, обычно используемые в процедурах аффинной хроматографии, приведены в таблице ниже.

Типичные биологические взаимодействия, используемые в аффинной хроматографии

Ст. Нет	Типы лигандов	Целевая молекула
1	Аналог субстрата	Ферменты
2	Антитела	Антиген
3	Лектин	Полисахарид
4	Нуклеиновая кислота	Дополнительная базовая последовательность
5	Гормон	Рецептор
6	Авидин	Биотин / биотин-конъюгированная молекула
7	Кальмодулин	Партнер связывания кальмодулина
8	Глутатион	Слитый белок GST
9	Белки А и G	Иммуноглобулины
10	Ионы металлов	Слитый белок с поли-гистидином

Пакетные и колоночные настройки

Иногда используется гибридный метод, при котором связывание осуществляется периодическим методом, но твердая фаза со связанной целевой молекулой набивается на колонку, а промывание и элюирование выполняются на колонке.

Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают как из органических, так и из неорганических источников. Примерами биологических источников являются сывороточные белки, лектины и антитела. Неорганические источники в виде дебильных веществ, хелатов металлов и триазиновых красителей.

Также был разработан третий метод, абсорбция расширенным слоем, который сочетает в себе преимущества двух методов, упомянутых выше. Частицы твердой фазы помещаются в колонну, где жидкая фаза закачивается снизу и выходит наверху. Плотность частиц гарантирует, что твердая фаза не покинет колонну с жидкой фазой.

Аффинные колонки можно элюировать путем изменения концентраций солей, pH, pI, заряда и ионной силы напрямую или с помощью градиента для разделения интересующих частиц.

Совсем недавно были разработаны установки, в которых последовательно используется более одной колонки. Преимущество по сравнению с установками с одной колонкой состоит в том, что полимерный материал может быть полностью загружен, поскольку несвязывающий продукт напрямую направляется в следующую колонку со свежим материалом колонки. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (PCC). Таким образом, можно резко снизить затраты на смолу на количество произведенного продукта. Поскольку одна колонка всегда может быть элюирована и регенерирована, в то время как другая колонка загружена, уже двух колонок достаточно, чтобы полностью использовать преимущества. Дополнительные колонки могут обеспечить дополнительную гибкость в отношении времени элюирования и регенерации за счет дополнительного оборудования и затрат на смолу.

Конкретное использование

Аффинная хроматография может использоваться в ряде приложений, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков из бесклеточных экстрактов и очистку из крови.

Используя аффинную хроматографию, можно отделить белки, которые связываются с определенным фрагментом, от белков, которые не связываются с этим конкретным фрагментом. Поскольку этот метод очистки зависит от биологических свойств необходимого белка, это полезный метод, и белки можно очищать во много раз за один этап.

Различные медиа по интересам

Существует множество различных аффинити-медиа для множества возможных применений. Вкратце, они (обобщенные) активированные / функционализированные, которые работают как функциональный спейсер, поддерживающая матрица и исключают работу с токсичными реагентами.

Аминокислотные среды используются с различными сывороточными белками, белками, пептидами и ферментами, а также с рРНК и дцДНК. Авидин-биотиновая среда используется в процессе очистки биотина / авидина и их производных.

Углеводное связывание чаще всего используется с гликопротеинами или любым другим углеводсодержащим веществом; углевод используется с лектинами, гликопротеинами или любым другим белком метаболита углеводов. Среда с красителем-лигандом неспецифична, но имитирует биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, меченных GST. Гепарин является лигандом с обобщенным сродством, и он наиболее полезен для разделения белков свертывания плазмы, наряду с ферментами нуклеиновых кислот и липазами.

Среды для гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для нацеливания на свободные карбоксильные группы и белки.

Иммуноаффинная среда (подробно описанная ниже) использует высокую специфичность антигенов и антител для разделения; аффинная хроматография с иммобилизованным металлом подробно описана ниже и использует взаимодействия между ионами металлов и белками (обычно специально помеченными) для разделения; нуклеотид / кофермент, который работает для разделения дегидрогеназ, киназ и трансаминаз.

Нуклеиновые кислоты улавливают мРНК, ДНК, рРНК и другие нуклеиновые кислоты / олигонуклеотиды. Метод белка A / G используется для очистки иммуноглобулинов.

Специальные среды разработаны для определенного класса или типа белка / кофермента; этот тип среды будет работать только для разделения определенного белка или кофермента.

Иммуноаффинность

Для тщательности каждый из белков GST и слитый с GST белок может быть соединен отдельно. Первоначально сыворотке дают возможность связываться с аффинной матрицей GST. Это удалит антитела против GST части слитого белка. Затем сыворотку отделяют от твердой подложки и дают возможность связываться с матрицей слитого с GST белка. Это позволяет любым антителам, распознающим антиген, улавливаться на твердой подложке. Элюирование представляющих интерес антител чаще всего достигается с использованием буфера с низким pH, такого как глицин pH 2,8. Элюат собирают в нейтральный трис- или фосфатный буфер, чтобы нейтрализовать элюирующий буфер с низким pH и остановить любое снижение активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного слитого с GST белка, для удаления нежелательных антител против GST из сыворотки и для очистки целевого антитела.

Моноклональные антитела также могут быть выбраны для связывания белков с высокой специфичностью, когда белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может быть использовано для дальнейших исследований в будущем.

Иммуноаффинная хроматография с моноклональными антителами, иммобилизованными на монолитной колонке, успешно использовалась для захвата внеклеточных везикул (например, экзосом и экзомеров) из плазмы крови человека путем нацеливания на тетраспанины и интегрины, обнаруженные на поверхности ЭВ.

Иммуноаффинная хроматография также является основой для иммунохроматографических тест-полосок (ICT), которые обеспечивают быстрый способ диагностики при лечении пациентов. Используя ИКТ, технический специалист может сделать определение у постели пациента без необходимости в лаборатории. Обнаружение ИКТ очень специфично для микроба, вызывающего инфекцию.

Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов

Рекомбинантные белки

Лектины

Специальность

Щелочная фосфатаза

Щелочная фосфатаза из E. coli может быть очищена с использованием матрицы DEAE-целлюлоза. A. фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать путем добавления буфера с более высокими концентрациями соли.

Боронатная аффинная хроматография

Очистка сывороточного альбумина

Слабая аффинная хроматография

История

Источник

Методы исследования структуры белков и пептидов

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Методы исследования структуры белков и пептидов

Аминокислоты, соединяясь пептидной связью, образуют полипептидные цепи. Линейная последовательность аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями, определяет первичную структуру белковой молекулы.

ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

I. Выделение белка из смеси в чистом виде (по одному из признаков: размер молекулы, заряд, специфическое сродство связывания). Определение М.

II. Определение N-концевой аминокислоты.

III. Определение С-концевой аминокислоты.

IV. Определение аминокислотной последовательности белковой цепи.

Выделение белка из биологического материала основано на его физико-химических свойствах. Чаще всего для этих целей используют кислотно-основные свойства белков (амфотерность, заряд молекулы, изоэлектрическое состояние).

От заряда белковых молекул зависит их:

При растворении в водной среде на поверхности белковой молекулы формируется гидратная оболочка.

Устойчивость белка в растворе зависит от:

Для выделения нативных белков (без изменения пространственной структуры) из биологического раствора используют методы:

При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.

Денатурация — нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).

МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Метод мембранных сит (диализ)

Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия).

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие.

Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na).

ДДС-Na является дифильным веществом и содержит заряженную группу и гидрофобную. Белки связываются с ДДС-Na своими гидрофобными радикалами и при этом денатурируют. Таким образом, белки выравниваются по форме и заряду. После этого подвижность белка при электрофорезе зависит только от его молекулярной массы.

Выделение индивидуальных белков

Аффинная хроматография

Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Молекулы веществ (лиманды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Изоэлектрофокусирование

Используется пластина с амфолином — веществом, у которого заранее сформирован градиент pH. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении. Белки разделяются в зависимости от заряда (изоэлектрическая точка). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Анализ гомологичных белков

Гомологичные белки — белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по первичной структуре (например, локализованы в различных органах или образуются при патологических состояниях). Например, HbA (содержит Glu) HbS (содержит Val) при серповидноклеточной анемии.

Метод пептидных карт (отпечатков пальцев), предложенный Ингремом.

УСТАНОВЛЕНИЕ АК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ БЕЛКА

I. Определение N-концевой АК

1. Метод Сэнжера (ФДНБ — фтординитробензол — связывается с N-концевой АК с образованием соединения желтого цвета).

2. Метод Эдмана (используется ФИТЦ — фенилизотиоцианат, который также связывается с N-концевой АК с образованием соединения оранжевого цвета).

3. Взаимодействие N-концевой АК с дансилхлоридом с образованием флуоресцирующего соединения.

4. Ферментативный метод (использование аминопептидаз — это ферменты которые избирательно отщепляют N-концевые АК, например, аланиновая аминопептидаза).

II. Определение С-концевой АК

1. Метод Акабори (гидразин разрушает все пептидные связи и реагирует со всеми АК, кроме концевой; концевую АК определяют после обработки смеси ФДНБ).

2. Ферментативный метод (карбоксипептидазы А отщепляют ароматические С-конце-вые АК, карбоксипептидазы В — основные С-концевые АК).

III. Определение АК-последовательности

1. Используют прибор секвенатор, предложенный Эдманом.

Источник

Разделение белков (фракционирование)

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с помощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам. При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с «порами», через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной «пор».

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рис. 1).

Рисунок 1. Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.

Ионообменная хроматография.Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCl, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 2). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Рисунок 2. Аффинная хроматография.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Ультрацентрифугирование.Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рис. 3). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Рисунок 3. Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α₁ глобулины, α₂-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 4). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Рисунок 4. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

Источник