Мукозит после химиотерапии что такое

Пропионовокислые бактерии в лечении мукозита, вызванного химиотерапией

Молочные пропионовокислые бактерии в терапии (смягчении) мукозита

Пробиотик Propionibacterium reudenreichii требует белка SlpB для смягчения мукозита, вызванного химиотерапией

Примечаие редактора

Исследование открывает новые перспективы для использования штаммов молочных пропионовокислых бактерий P. freudenreichii или экстрагированных от них белков поверхностного слоя SlpB, участвующих в адгезии, для облегчения воспалительного процесса мукозита, особенно с учетом того, что клинические рекомендации по лечению мукозита недавно добавили предложение по использованию пробиотиков. С этой целью следует глубже исследовать безопасность потребления P. freudenreichii (уже имеющих статус GRAS ) онкологическими больными с ослабленным иммунитетом и слизистым барьером.

Мукозит полости рта и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) поражает практически всех пациентов, которым проводят химиотерапию в высоких дозах и трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток ( HSCT ), а также 80% пациентов со злокачественными новообразованиями головы и шеи, получающих лучевую терапию, и широкий круг пациентов, получающих химиотерапию. Слизистая оболочка пищеварительного тракта повышает смертность и заболеваемость и способствует росту расходов на здравоохранение.

Для большинства видов лечения рака около 5–15% пациентов получают мукозит. Однако при использовании 5-фторурацила (5-FU) мукозитом заболевают до 40%, а у 10–15% появляется оральный мукозит 3-4 степени. При оральном мукозите 3 степени пациент не может есть твердую пищу, а при 4 степени пациент также не может потреблять жидкости.

Лучевая терапия головы и шеи или таза или брюшной полости связана с воспалением слизистой оболочки полости рта 3 или 4 степени, соответственно, часто возникающим у более 50% пациентов. У пациентов, проходящих лучевую терапию головы и шеи, боль и снижение функции полости рта могут сохраняться еще долго после завершения терапии. Фракционированная дозировка облучения увеличивает риск мукозита более чем у 70% пациентов в большинстве исследований. Оральный мукозит особенно выражен и пролонгирован у реципиентов HSCT, получающих облучение всего тела.

На рисунке указана патобиология мукозита

Резюме

ВВЕДЕНИЕ

Пробиотические эффекты P. freudenreichii также включают модуляцию кишечной микробиоты и иммунной системы кишечника [2]. В 2012 году Cousin et al. показали, что молочные пропионибактерии индуцируют продукцию регуляторного цитокина IL-10 ex vivo в эксплантах слизистой оболочки толстой кишки свиней и снижают продукцию провоспалительных цитокинов, таких как IL-8 и фактор некроза опухоли-α (TNFa), в слизистой оболочке кишечника поросят после стимуляции липополисахаридами ( LPS ) [4].

Также было показано, что штаммы P. freudenreichii, изолированные или связанные с другими пробиотическими бактериями, ослабляют колит, индуцированный тринитробензолсульфоновой кислотой ( TNBS ), у мышей BALB / c [5]. Сообщалось также, что P. freudenreichii уменьшает кишечные и системные провоспалительные изменения, вызванные диетой с высоким содержанием жиров, на мышиной модели [6]. Кроме того, штаммы молочных пропионибактерий могут облегчить симптомы и стабилизировать кишечную микробиоту у пациентов с синдромом раздраженного кишечника [7]. В целом, эти исследования привлекли внимание к P. freudenreichii как к перспективному пробиотику для потенцирования лечения воспалительных заболеваний [1].

Штамм P. freudenreichii ITGP20, эквивалентный CIRM-BIA 129 (P. freudenreichii дикого типа, WT), использовали для разработки двух экспериментальных сыров, одного одноштаммового и одного в сочетании с Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNRZ327. Оба сыра дали многообещающие результаты и ослабили TNBS-индуцированный колит у мышей [8, 9]. Было показано, что противовоспалительный эффект P. freudenreichii зависит от специфических экстрагируемых поверхностных белков [10]. В результате поверхностного протеомного анализа экстрагируемых поверхностных белков P. freudenreichii были идентифицированы три поверхностно-экспонированных белка, обозначенных SlpA, SlpB и SlpE [10]. Интересно, что экстракция поверхностных белков из P. freudenreichii WT гидрохлоридом гуанидина подавляет его способность индуцировать противовоспалительные цитокины в РВМС человека [10]. Более того, в P. freudenreichii WT, Carmo и соавторы подтвердили, что поверхностный белок SlpB участвует в адгезии к культивируемым эпителиальным клеткам кишечника человека HT-29 [11], а мутация гена slpB вызывала резкие изменения поверхностных свойств [12]. В этом контексте большой пробиотический потенциал P. freudenreichii в контексте воспалительных заболеваний кишечника [8, 9] и наличие характерного экстрагируемого поверхностного белка SlpB с иммуномодулирующей активностью [13] побудили нас бросить вызов этой бактерии в другой животной модели, включающей такое воспаление, как химиотерапевтический мукозит [14].

Целью данного исследования является оценка пробиотической способности P. freudenreichii CIRM-BIA 129 защищать мышей от повреждений воспалительного мукозита, вызванных 5-FU, и дальнейшее изучение влияния мутации гена slpB на такую защиту.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Propionibacterium freudenreichii WT, но не мутант P. freudenreichii ΔslpB, предотвращает вызванное LPS воспаление в клетках HT-29

Мы исследовали противовоспалительный потенциал P. freudenreichii WT и влияние мутации гена slpB на этот потенциал. Клетки НТ-29, как в присутствии, так и в отсутствии провоспалительного липополисахарида (LPS) из E. coli, подвергались воздействию обоих штаммов, WT и мутантного. Мы наблюдали изменения относительной экспрессии генов, участвующих в воспалительном процессе (Рис.1).

Рисунок 1. Мутантный штамм Propionibacterium freudenreichii ΔslpB индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов в клетках HT-29

P. freudenreichii WT индуцировал экспрессию il-10 (рис. 1А) со значимыми различиями (Р ifn-α (Р tnf-α был индуцирован LPS, но не P. freudenreichii, ни WT, ни мутантом (рис.1D). WT подавлял LPS-опосредованную индукцию tnf-Α, в то время как мутант этого не делал.

Рисунок 2. Штамм Propionibacterium freudenreichii WT модулирует экспрессию invitro в Toll-подобных рецепторах (TLR) в клетках HT-29

Что касается экспрессии рецепторного гена tlr4 (рис. 2B), то он индуцировался LPS по сравнению с необработанным контролем (p

Ни LPS, ни P. freudenreichii WT существенно не модифицировали экспрессию tlr9 по сравнению с контролем (рис. 2C). В контрольных условиях экспрессия tlr9 была значительно ниже в присутствии мутанта, чем в присутствии WT. В LPS-воспаленных клетках наблюдалась противоположная картина с более высокой экспрессией в присутствии мутанта, чем в присутствии WT (Р

Что касается гена плотного соединения zo1 (рисунок 2D), мы не обнаружили существенных различий между контрольными необработанными клетками и стимулированными клетками. В LPS-воспаленных клетках muc2 (рисунок 2E) был более выражен в присутствии мутанта, чем в присутствии WT (p

Propionibacterium freudenreichii WT, но не мутант P. freudenreichii ΔslpB, улучшает сохранение слизистой оболочки подвздошной кишки мышей, получавших 5-FU

Рисунок 3. Штамм Propionibacterium freudenreichii WT предотвращает потерю веса у мышей, получавших 5-FU

Рисунок 4. Штамм Propionibacterium freudenreichii WT облегчает повреждение слизистой оболочки подвздошной кишки мышей, получавших 5-FU, тогда как мутантный штамм P. freudenreichii ΔslpB вызывает воспаление у здоровых мышей.

Кроме того, мы измерили высоту ворсин и глубину крипт (рис. 5). Не было значительного различия между контрольными группами, которым вводили физиологический раствор. В группах, получавших 5-FU, наблюдалось уменьшение высоты ворсинок. Потребление P. freudenreichii WT частично восстановило эту высоту (p> 0,0001) по сравнению с группами, получавшими либо воду, либо P. freudenreichii ΔslpB (рис. 5А). Не было обнаружено существенных различий между группами, получавшими 5-FU или не-5-FU, с точки зрения глубины крипт (рис. 5В).

Рисунок 5. Штамм Propionibacterium freudenreichii WT защищает архитектуру ворсинок и плотность секреторных гранул клеток Панета при 5-FU-индуцированном мукозите

Морфометрический анализ высоты ворсинок (А), глубины крипты (B) и соотношения высоты ворсинок/глубины крипты (C) мышей, обработанных культуральной средой YEL (контроль), пробиотическим штаммом P. freudenreichii WT и мутантным штаммом P. freudenreichii ΔslpB или без обработки (вода) после введения 5-FU или физиологического раствора. Микроскопический морфометрический анализ секреторных гранул клеток Панета (D) мышей, обработанных культуральной средой YEL (контроль), пробиотическим штаммом P. freudenreichii WT и мутантным штаммом P. freudenreichii ΔslpB или без обработки (вода) после введения 5-FU или физиологического раствора. Значения были получены с помощью объективного увеличения в 40 раз путем измерения десяти случайных изображений подвздошной кишки мышей. Средние и стандартные отклонения рассчитаны по срезу подвздошной кишки 18 животных на группу (три независимых повтора по 6 животных на группу). Звездочки представляют статистически значимые различия следующим образом: *Р

Ни одна из обработок не оказывала существенного влияния на гранулярную плотность клеток Панета в отсутствие 5-FU. В контексте 5-FU-мукозита гранулярная плотность была снижена. Хотя мутантный штамм не оказывал влияния на это снижение, как YEL, так и P. freudenreichii WT ограничивали это уменьшение (рис.5D).

Propionibacterium freudenreichii WT, но не мутант P. freudenreichii ΔslpB, предотвращает индуцируемую 5-FU проницаемость кишечника

Рисунок 6. Потребление Propionibacterium freudenreichii WT снижает проницаемость кишечника у мышей, получавших 5-FU

Проницаемость кишечника измеряли через 72 ч после индукции мукозита путем определения радиоактивности технеция-99 м ( 99 m Tc-DTPA) в крови мышей. Средние и стандартные отклонения были рассчитаны на основе одного независимого эксперимента для каждой из пяти мышей в каждой группе. Звездочки представляют собой статистически значимые различия между штаммами и были обозначены следующим образом: *Р

Мутант Propionibacterium freudenreichii ΔslpB, но не штамм WT, индуцирует продукцию клеток Th17 в селезенке мышей

Рисунок 7. Мутантный штамм Propionibacterium freudenreichii ΔslpB индуцирует продукцию Т-лимфоцитов в селезенке мышей после 5-FU-индуцированного мукозита

Propionibacterium freudenreichii снижает выработку секреторного IgA

Концентрация секреторного IgA (SIgA) в тонкой кишке мышей, получавших 5-FU и не-5-FU, была измерена (рис. 8). Инъекция 5-FU увеличивала SIgA по сравнению с необработанными мышами. Эта индукция была полностью подавлена потреблением обоих штаммов. Действительно, как P. freudenreichii WT, так и P. freudenreichii ΔslpB снижали количество SIgA в группах, получавших 5-FU и не получавших 5-FU.

Рисунок 8. Секреторный иммуноглобулин А (IgA) в содержимом тонкой кишки

Количественное определение секреции иммуноглобулина А (sIgA) в тонком кишечнике здоровых или обработанных 5-FU мышей. Средние и стандартные отклонения рассчитаны по срезу подвздошной кишки 18 животных на группу (три независимых повтора по 6 животных на группу). Звездочки представляют статистически значимые различия следующим образом: * Р

Мутантные штаммы Propionibacterium freudenreichii WT и ΔslpB дифференцированно модулируют экспрессию генов в подвздошной кишке мышей

У здоровых мышей (которым вводили физиологический раствор) и у мышей, которым вводили 5-FU, не было обнаружено существенных различий в экспрессии гена muc2 (рис.9А). Потребление P. freudenreichii WT достоверно повышало уровень экспрессии гена cld1 у мышей, которым вводили 5-FU, по сравнению с водой (Р zo1 только показали достоверные различия (Р Окклюдина контролировалась, и существенной разницы не было обнаружено (рис.9D). Экспрессия iNOS (индуцибельной синтазы оксида азота) была слабо изменена, за исключением тенденции к усилению экспрессии в результате потребления мутантного штамма, по сравнению с группами, получавшими воду (Р IL-17 у здоровых мышей (Р

Рисунок 9. Propionibacterium freudenreichii ΔslpB индуцирует экспрессию IL-17 и индуцибельную NOS (iNOS) у здоровых мышей. Относительная экспрессия мРНК генов (A) muc2, (B) cld1, (C) zo1, (D) ocln, (E) iNOS и (F) Il17 у мышей, обработанных культуральной средой YEL (контроль), пробиотическим штаммом P. freudenreichii WT и мутантным штаммом P. freudenreichii ΔslpB или без обработки (вода) после введения 5-FU или физиологического раствора. Уровень экспрессии контролировали методом ОТ-ПЦР. Средние и стандартные отклонения рассчитывались от 6 животных в группе из 3 независимых повторов, и каждая количественная оценка проводилась в трех экземплярах (технические триплики). Звездочки представляют собой статистически значимые различия между штаммами и были обозначены следующим образом: *Р

Мутантные штаммы Propionibacterium freudenreichii WT и ΔslpB дифференцированно модулируют выработку цитокинов в подвздошной кишке мышей

Цитокины были количественно определены методом ИФА в слизистой оболочке кишечника 5-фу-обработанной (5-FU) и не-5-FU-обработанной групп (физиологический раствор) (рис.10). В условиях мукозита (5-FU) болезнь резко индуцировала все измеренные цитокины. Потребление P. freudenreichii WT увеличивало концентрацию IL-10 в подвздошной кишке у здоровых мышей (Р

Рисунок 10. Штамм Propionibacterium freudenreichii WT снижает выработку провоспалительного цитокина IL-12 при 5-FU-индуцированном мукозите.

Секретируемые уровни соотношения (A) IL-10, (B) IL-12, (C) IL-1β и (D) IL-10 / IL-12 определяли в супернатанте гомогенизированной ткани подвздошной кишки мышей с помощью ИФА. Мыши потребляли воду, культуральную среду YEL (контроль YEL), культуру YEL пробиотического штамма P. freudenreichii WT (дикого типа) или культуру YEL мутантного штамма (ΔslpB). Средние значения и стандартные отклонения рассчитывают по 6 животным на группу из 3 независимых повторностей, и каждое количественное определение проводили в трех экземплярах (технические триплики). Звездочки представляют статистически значимые различия между штаммами и были обозначены следующим образом: *р

ОБСУЖДЕНИЕ

Пробиотический потенциал Propionibacterium freudenreichii основан как на высвобождении полезных метаболитов [1], так и на ключевых поверхностных белках, ответственных за взаимодействие с хозяином [12, 13, 23-24]. Белки S-слоя образуют нековалентно закрепленную поверхностно-открытую белковую сеть [25, 26]. Они участвуют в различных процессах, таких как опосредование перекрестного разговора с хозяином [23], которое включает иммуномодуляцию [10] и адгезию к клеткам-хозяевам у P. freudenreichii [11]. Иммуномодуляция и адгезия, два тесно связанных процесса [27], требуют s-слоя ассоциированных белков в Lactobacillus salivarius REN [28] и в Lactobacillus acidophilus NCFM [29, 30]. У P. freudenreichii WT адгезия к клеткам кишечника человека требует SlpB [11]. Кроме того, мутация гена slpB вызывала плеотропные эффекты, ухудшающие свойства поверхности, адгезию и стрессоустойчивость [12]. Поэтому мы исследовали влияние этой мутации на воспаление эпителиальных клеток кишечника человека.

В настоящем докладе подтверждается ключевая роль SlpB в пробиотическом потенциале P. freudenreichii. В клетках HT-29 P. freudenreichii WT обладает способностью индуцировать высвобождение IL-10 и снижать высвобождение IL-8 [31]. Способность индуцировать IL-10 играет решающую роль в предотвращении повреждений при воспалительных процессах [32, 33]. Здесь было показано, что штамм P. freudenreichii ΔslpB теряет эту способность индуцировать IL-10, вероятно, из-за 1) основных модификаций свойств клеточной поверхности [12] и 2) снижения адгезии [11]. Соответственно, очищенный белок SlpB P. freudenreichii индуцировал экспрессию IL-10 в клетках HT-29. Действительно, штаммы P. freudenreichii, которые экспрессируют SlpB, индуцируют IL-10 в РВМС, тогда как штаммы, которые продуцируют большое количество SlpA, этого не делают [13].

Способность ограничивать индукцию IL-8 также важна в противовоспалительном эффекте, поскольку IL-8 запускает рекрутирование нейтрофилов в дополнение к дальнейшим провоспалительным сигналам в пластинке propria [34, 35]. SlpB также может быть ответственен за способность понижать регуляцию IL-8, противовоспалительного свойства, разделяемого несколькими пробиотиками [36]. Интересно, что мутантный штамм, лишенный SlpB, утратил способность регулировать экспрессию IL-8, что может снижать их противовоспалительный потенциал. Это также наблюдается в отношении TNF-α, провоспалительного цитокина, который контролирует выработку другого медиатора воспаления. P. freudenreichii WT подавлял экспрессию TNF-α в LPS-стимулированных клетках HT-29, как сообщалось для других пробиотических бактерий или супернатантов их культур [37, 38]. Опять же, мутантный штамм P. freudenreichii ΔslpB не смог ингибировать индукцию провоспалительных цитокинов.

Пробиотические бактерии могут модулировать TLRs в зависимости от штамма. Например, L. plantarum BFE 1685 и L. rhamnosus GG усиливают экспрессию TLR2 и TLR9 в клетках HT-29 [51]. L. paracasei F19 сильно индуцирует TLR2 и E. Coli K4-индуцированный TLR4 [52]. L. rhamnosus GG ограничивает воспалительный ответ эпителиальных клеток кишечника свиньи, подвергшихся воздействию LPS, путем модуляции экспрессии TLR и ингибирования передачи сигналов MAPK и NF-κB [53]. Напротив, Lactobacillus rhamnosus LGG снижает экспрессию TLR2 и TLR-9 в клетках HT-29, подвергшихся воздействию сальмонелл или LPS [51, 53]. Каждый пробиотический штамм имеет свои специфические свойства и может специфически модулировать экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов и рецепторов в HIECs (т.е. в человеческих кишечных эпителиальных клетках – ред.).

Мукозит, индуцированный 5-FU, связан с воспалительным процессом и значительно изменяет проницаемость кишечника [67]. Мы сообщаем здесь, что потребление Propionibacterium freudenreichii WT предотвратило это изменение, что показывает на потенциал, который может предотвратить воздействие на хозяина токсинов кишечника и бактерий, вызванных кишечной пермеабилизацией и, следовательно, системным воспалением [68]. Индуцированный мукозит, соответственно, связан со снижением экспрессии гена Claudin-1 (Клаудин-1) [69]. Действительно, структура плотных контактов является существенным фактором целостности эпителиального барьера [70, 71]. Не наблюдалось значительного эффекта различных обработок в отношении экспрессии генов, кодирующих белки ZO-1 и Muc2. Однако лечение пробиотиком P. freudenreichii WT увеличивало экспрессию гена cld1 в группе, получавшей 5-FU. Клаудин-1 участвует в образовании плотных соединений и межклеточной адгезии эпителиальных клеток [72]. Потребление P. freudenreichii WT снижало уровень IL-12 в подвздошной кишке, который был повышен на модели мукозита [73]. Здоровые мыши (без 5-FU), потребляющие P. freudenreichii WT (группа 1), демонстрировали повышенные уровни иммуномодулирующего IL-10, маркера противовоспалительного эффекта, также сообщаемого для Lactobacillus acidophilus [74]. Они показали более высокое отношение IL-10 / IL-12, которое было предложено в качестве маркера противовоспалительного пробиотического эффекта [75]. Кроме того, это соотношение было также увеличено у мышей с мукозитом, потребляющих P. freudenreichii (группа 7). Вполне вероятно, что IL-10 играл ключевую роль в воспалительном процессе (после применения P. freudenreichii WT), вызванном 5-FU, учитывая важность этого цитокина в гомеостазе кишечника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Данный раздел пропущен, он содержит чисто технические этапы подготовки и проведения исследования. Самостоятельно с его информацией можно ознакомиться в источнике. В него входят следующие подпункты:

Оценка пробиотических свойств P. freudenreichii WT и P. freudenreichii ΔslpB для профилактики мукозита.

Относительная экспрессия цитокинов у мышей подвздошной кишки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Это исследование подтвердило противовоспалительные эффекты штамма P. freudenreichii ITGP20, эквивалентного CIRM-BIA 129. В контексте индуцированного мукозита этот пробиотик уменьшал воспаление, ограничивал гистопатологические повреждения и восстанавливал проницаемость кишечника. Это важно в контексте химиотерапевтического мукозита, чтобы предотвратить возможную транслокацию патогенов и системное воспаление и инфекцию. Кроме того, эта работа продемонстрировала с помощью подходов in vitro и in vivo, что мутация гена экстрагируемого поверхностного белка slpB непосредственно влияет на пробиотические эффекты P. freudenreichii. Об этом в основном свидетельствует тот факт, что P. freudenreichii ΔslpB теряет способность регулировать провоспалительные цитокины в стимулированных LPS клетках HT-29 и облегчать вызванный 5-FU мукозит. Это открывает новые перспективы для изучения белков S-слоя как возможных адъювантов при лечении мукозита. Понимание механизма, ответственного за этот защитный эффект, углубляет знания об иммуномодулирующих свойствах Пропионибактерий. Это открывает новые перспективы для использования этого штамма или экстрагированного SlpB для облегчения воспалительного процесса мукозита. Клинические рекомендации по лечению мукозита недавно добавили предложение по использованию пробиотиков. P. freudenreichii, насколько нам известно, получил статус GRAS за его использование в сыре, для здорового населения. С этой целью следует исследовать безопасность его потребления онкологическими больными с ослабленным иммунитетом и слизистым барьером. Кроме того, метагеномные исследования должны касаться влияния на структуру и активность кишечной микробиоты, учитывая, что отдельные штаммы P. freudenreichii продуцируют бифидогенные факторы и другие нутрицевтические соединения, которые могут модулировать комменсальную микробиоту.

Будьте здоровы!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

Источник